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最近做连接转化出现个问题，连接后提质粒大小比原载体缩了6倍? 最近做连接转化出现的问题，请大家帮忙解答一下。不胜感激！我是把7000多的片段连到11000的载体上，双酶切连接。目的片段通过pcr获得，载体是用的以前构建好的，具体的是载体质粒15000，切下4000多，回收11000的片段作为载体。连接体系中，目的片段：载体=5:1（目的片段的浓度为15ng/ul，载体浓度为45ng/ul，目的片段加了1ul，目的片段加了16ul）,16度过夜连接，大约14个小时。涂板子后，长了很多菌5、6百个吧（氨苄抗性），挑菌，摇菌提质粒后，跑电泳，质粒大小才2500左右。提了30个均如此。排除的原因有： 1、氨苄失效？重新制备了板子，还是一样长很多菌但无阳性的。也从别的实验室借过板子结果一样。 2、感受态有问题？新买了感受态，而且空涂感受态，并不长菌。也借过别的实验室的感受态做过。 3、连接酶有问题？新买了连接酶。 4、如果说是空载体，那么也不能这么小啊。而且双酶切，粘性末端，自连的可能性也比较小吧，即使自连那么提出的质粒也应该10000左右，而不是2500左右啊。各位请帮忙分析下，还有什么原因会造成这样的结果呢？查看更多 5个回答 . 19人已关注

#提质粒

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EDC/NHS形成酰胺键的反应条件是什么? 水相中：将PEG-COOH 与氨基修饰的DNA，在EDC/sulfo-NHS MES中（pH6.0）中活化20min，加入三乙胺调节pH7.0以上反应2小时，形成酰胺键。采用琼脂糖凝胶表征产物，显示完全没有偶联成功。也做了PEG-NHS 与氨基修饰的DNA，在上述反应中反应，结果同上。有机相中：我的DNA是水溶性的，所以我换与水互溶的DMSO,加入EDC/sulfo-NHS 三乙胺，反应同上。PEG-NHS与PEG-COOH都做了，结果同上。反应比例：物质的量比COOH：EDC：sulfo-NHS=1:4:2 ,1:1000:500 都做过。羧基与氨基比1:1 至100：1都做过。查了许多文献，也看了EDC/sulfo-NHS 的protocol，大家都这么做出来了，所以我的问题到底出在哪里？还有哪个细节没有注意到？望指导感激不尽。查看更多 1个回答 . 15人已关注

#酰胺键

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请问变色酸溶液应该如何配制？ 手头有变色酸固体，浓硫酸查看更多 1个回答 . 3人已关注

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做胞内IL-6的WB,但是却没有条带? 做胞内IL-6的WB,但是却没有条带。求教各位大神，有无类似经历，究竟是什么原因导致的，此外，小鼠源IL-6的分子量是多少？上样量达到了40kD，但是仍然做不出来东西，感觉好奇怪。查看更多 2个回答 . 10人已关注

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emsa实验中样品堆积在上样孔跑不下去，怎么办? 用放射性方法，做的是ap－1,每次都是只有浅浅的小黑团，条带并不锐利，上样孔却残留了特别浓重的黑团尝试了探针和蛋白用量减半，依然如此，求助，是否是配胶的问题，甲× 丙烯酰胺溶解不是太好，一直有些沉淀没有溶解，是否会影响到结果？谢谢！查看更多 2个回答 . 17人已关注

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聚醚型水溶聚氨酯胶是属于单组份还是双组份 ? 聚醚型的水溶聚氨酯胶，用这种胶在常温下粘合瓷砖和发热体（碳纤维），附件是这种胶的检测报告，但是看不懂。。。。这种物质是属于单组份还是双组份？在常温下使用会不会产生挥发性气体或者说在达到多少温度下会挥发，产生的挥发气体主要是什么？顺带给出相应的依据。。。。谢谢大神，请听说或者知道或者了解的人帮忙解答一下呐查看更多 2个回答 . 2人已关注

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做SDS-PAGE时胶总有气泡,怎么回事? 在做SDS-PAGE时,倒的是12%的下层分离胶, H2O: 1.23ml, 甲叉丙烯酰胺30%:1.7ml, Tris-hcl(ph8.8, 1.5M): 0.95ml, 10%sds: 38ul, aps:38ul, TMEMD: 3ul.奇怪的是在胶的两侧出现了不少绿豆大小的气泡,请高人指教.是否因为天气转暖, TEMED量加过了? 查看更多 3个回答 . 4人已关注

#SDS-PAGE

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能看看这张大鼠脑尼氏染色片有大量空泡，水分没有脱干产生了冰晶吗？染色步骤出现问题了? 冰冻切片，大鼠脑尼氏染色后出现了大量空泡，是蔗糖梯度沉降时水分没有脱干产生了冰晶吗？还是染色步骤出现问题了？查看更多 3个回答 . 8人已关注

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造山后与后造山阶段有什么区别与联系? 威尔逊循环可分为好几个阶段，造山后与后造山阶段有什么不同查看更多 1个回答 . 9人已关注

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合成MOF？合成MOF时，合成条件和配比跟之前一样，之前合成的MOF形貌较好，现在合成出来的没有形貌了，想问问是原料的问题吗，还是有其他的原因，求解答查看更多 2个回答 . 11人已关注

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玻璃粉造粒，用醇解度是多少的PVA合适? 请问，玻璃粉造粒，用醇解度是多少的PVA合适？另外造粒的具体步骤是什么？十分感谢！查看更多 1个回答 . 9人已关注

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请问哪里可以测中子衍射? 想测中子衍射，不知道那些学校或机构可以测，有木有大神知道啊 1.jpg查看更多 2个回答 . 9人已关注

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采用直流极化法测试一开始电流就出现恒定值？ 测试质子数迁移时，直流极化法测试出现恒定值是什么情况？采用的是辰华工作站 ch600，chronoamperometry和amperometric i-t都试了，是恒定值查看更多 2个回答 . 3人已关注

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常压储罐罐？ 上面这三组阀干嘛用的查看更多 1个回答 . 20人已关注

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把R-CN常压氢化成R-CH2-NH2，怎么做比较好? 哪位朋友做过R-CN常压氢化成R-CH2-NH2，望赐教。查看更多 2个回答 . 9人已关注

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单晶结构解析？在线急求有会用olex软件或其他解单晶软件的大神，帮忙解一个单晶，结构确定。单晶已经测定，但是老师没有给解，简单的金属络合物，跪求！！！查看更多 3个回答 . 4人已关注

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药明康德怎么样？ 算是合成的“黄埔”啦，进去走一遭吧查看更多 3个回答 . 10人已关注

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乳膏相容性试验？乳膏相容性试验怎么做呢？乳膏中有的辅料是固体，有的是液体，也有半固体膏状的东西，原辅料混合有点困难，采用什么方法让原料和单个辅料相混合呢？查看更多 1个回答 . 12人已关注

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谢沐风：针对埃索美拉唑钠与注射用埃索美拉唑钠申报材料的点评与随想？ 谢沐风发布于丁香园新药信息版：针对埃索美拉唑钠与注射用埃索美拉唑钠申报材料的点评与随想查看更多 15个回答 . 18人已关注

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做药与搞化学，哪个更有前途? 做药物研发和搞化学研究，哪个更有前途？专指在学术方面，以后能进高校、科研单位的，不考虑进公司、工厂的。查看更多 24个回答 . 17人已关注

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简介

职业：清远市宏图助剂有限公司 - 销售

学校：山东胜利职业学院 - 化学化工

地区：甘肃省

个人简介：如果你想获得幸福和安宁，那就要越过层层的障壁，敲起真理的钟前进。查看更多

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