人Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)ELISA试剂盒的应用及操作步骤? 人Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)ELISA试剂盒是一种用于测定标本中人Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)水平的双抗体夹心法。该试剂盒利用纯化的人Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)抗体包被微孔板,形成固相抗体。然后,将Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)加入微孔中,并与HRP标记的Γ-GTP抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后,加入底物TMB进行显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,最终转化成黄色。颜色的深浅与样品中的Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)呈正相关。通过酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),可以计算样品中人Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)的浓度。 如何操作该试剂盒? 1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 3. 样本孔中加入待测样本50μL,空白孔不加。 4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。 6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。 人Y一谷氨酞转肤酶(Γ-GTP)ELISA试剂盒的应用 该试剂盒在谷胱甘肽前体合成中的应用研究 利用Bacillus subtilis NX-2菌株的γ-谷氨酰转肽酶为催化剂,以L-谷氨酰胺作为γ-谷氨酰基供体,S-苄基-半胱氨酰甘氨酸作为γ-谷氨酰基受体,进行酶促转肽反应合成S-苄基-谷胱甘肽。该方法简化了反应流程,提高了反应收率,省去了化学合成法中复杂的保护和脱保护处理工序。 首先对S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的合成工艺条件进行了优化,通过氨基保护、与甘氨酸甲酯的接肽以及氨基的脱保护,得到了S-苄基-半胱氨酰甘氨酸。研究结果表明,三步合成反应的反应转化率分别可以达到84.2%、88.9%和91%。 然后,对本实验室所保藏的Bacillus subtilis NX-2菌株进行发酵产酶研究,对获得的γ-谷氨酰转肽酶进行初步纯化。此后,对γ-谷氨酰转肽酶粗酶性质做了初步研究,考察了该粗酶的pH稳定性和最适pH、温度稳定性和最适温度以及金属离子对γ-谷氨酰转肽酶活性的影响。研究结果表明,该酶在pH7.0~10.0稳定性最好,最适催化反应pH值为8.0;在低于40℃的温度下,该酶有着较好的稳定性,最适催化反应温度为40℃;K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+的存在对该酶的活性不产生明显的抑制作用,而Fe2+、Fe3+、Hg2+则对该酶表现出明显的抑制作用。 参考文献 [1] The Sec-dependent pathway[J]. Jon Beckwith. Research in Microbiology. 2013(6) [2] Development of efficient enzymatic production of theanine byγ‐glutamyltranspeptidase from a newly isolated strain of Bacillus subtilis, SK11.004[J]. Yuying Shuai, Tao Zhang, Bo Jiang, Wanmeng Mu. J. Sci. Food Agric.. 2010(15) [3] Enhanced secretion of recombinantα-cyclodextrin glucosyltransferase from E.coli by medium additives[J]. Runrong Ding, Zhaofeng Li, Sheng Chen, Dan Wu, Jing Wu, Jian Chen. Process Biochemistry. 2010(6) [4] L‐theanine intervention enhances humanγδT lymphocyte function[J]. Jack F Bukowski, Susan S Percival. Nutrition Reviews. 2008(2) [5] 贺忠. γ-谷氨酰转肽酶在谷胱甘肽前体合成中的应用研究[D]. 南京工业大学, 2004. 查看更多