DNA磷酸化试剂盒可以将DNA分子的5′端的-OH基团磷酸化，从而使处理后的DNA可以直接用于连接反应和克隆等操作，无需进行纯化步骤。

人工合成的PCR引物、linker和adaptor的5′端通常是-OH基团，而不是-PO4基团（除非额外付费要求在人工合成时加上-PO4基团）。然而，任何DNA连接酶都无法将一个DNA分子的5′端的-OH基团和另一个DNA分子的3′端的-OH基团连接起来。因此，人工合成的DNA片段与天然DNA之间的连接效率通常较低（人工合成的DNA只有2个连接端口，而天然DNA有4个连接端口），尤其是在平末端连接时。通过使用DNA磷酸化试剂盒，可以快速将DNA的5′端的-OH基团转化为-PO4基团，使得人工合成的DNA具有与天然DNA相同的高连接效率。

DNA磷酸化试剂盒

实验步骤：

注意：如果使用PCR产物，必须先进行胶回收，不能使用未经纯化的PCR反应液，因为其中残留的PCR引物会消耗大量的激酶，降低磷酸化效率。

1、在微量离心管中配制以下反应液（20μL）：

成分 用量

PCR胶回收片段 2μL（不超过10 pmol）

10×TPK缓冲液 2μL

ATP溶液（10 mM） 5μL

T4多核苷酸激酶（10U/uL） 1μL

超纯水 加至20μL

2、在37℃下反应30分钟。

3、在70℃下热处理5分钟，灭活酶。

4、可直接用于后续克隆（加入量不要超过总体积的1/5）。

应用

如何利用DNA磷酸化进行纳米孔单分子检测研究？

利用α-溶血素（α-hemolysin,α-HL）蛋白质纳米孔作为传感元件，设计了使用发夹结构的DNA进行磷酸化和T4多聚核苷酸激酶的单分子检测分析。

通过设计带有发夹结构的DNA进行磷酸化检测，利用α-HL（WT）7纳米孔研究了四类未磷酸化和磷酸化DNA的特性。研究发现，3’-磷酸化和5’-磷酸化发夹DNA的稳定性远低于对应的未磷酸化发夹DNA，磷酸化发夹DNA的滞留时间约为未磷酸化发夹DNA的十分之一。

电压和盐浓度变化实验表明，5’端或3’端的磷酸与主链上的磷酸酯之间产生的静电排斥作用降低了双链的稳定性，导致解链时间减少。随着碱基配对数的增加，5’端折叠的发夹DNA（5’-hp DNA）和3’端折叠的发夹DNA（3’-hp DNA）的log（Duration（ms））数值分别呈线性增加，且二者的线性直线逐渐接近。

通过分析发夹DNA与阿霉素（Dox）结合物的信号，发现阿霉素的加入增强了发夹DNA的稳定性。此外，由于5’-磷酸化发夹DNA末端的磷酸根基团与Dox之间的相互作用削弱了磷酸根与主链磷酸基团的静电相斥作用，使得磷酸化的发夹DNA与Dox络合物的稳定性提高更为明显。

因此，利用这一体系可以快速检测和分析未磷酸化和磷酸化发夹DNA，并研究发夹DNA与药物分子的结合。相比其他检测方法，这种方法简单、快速，无需放射性标记和纳米孔修饰，为检测DNA磷酸化以及分析磷酸化和药物分子对DNA结构的影响提供了新途径。

参考文献

[1]Recent Progress in Solid‐State Nanopores[J].Kidan Lee,Kyeong‐Beom Park,Hyung‐Jun Kim,Jae‐Seok Yu,Hongsik Chae,Hyun‐Mi Kim,Ki‐Bum Kim.Advanced Materials.2018(42)

[2]Insight into How Telomeric G‐Quadruplexes Enhance the Peroxidase Activity of Cellular Hemin[J].Tingting Ai,Qiufang Yang,You Lv,Yuqin Huang,Yuzhi Li,Jia Geng,Dan Xiao,Cuisong Zhou.Chemistry–An Asian Journal.2018(14)

[3]A label-free assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on poly（thymine）-templated copper nanoparticles[J].Zhen-Zhen Dong,Lin Zhang,Min Qiao,Jia Ge,Ai-Ling Liu,Zhao-Hui Li.Talanta.2016

[4]The Classification and Evolution of Enzyme Function[J].Sergio Martínez Cuesta,Syed Asad Rahman,Nicholas Furnham,Janet M.Thornton.Biophysical Journal.2015(6)

[5]赵莹莹.DNA磷酸化及T4多聚核苷酸激酶的纳米孔单分子检测研究[D].西北大学,2020.