生物医学工程细胞及分子

毕赤酵母分泌表达上清过镍柱，表达上清需要如何处理才能上样?

兄弟姐妹们，最近在做毕赤酵母纯化这一块，我的目的蛋白37kda，等电点为9.2，带his标签，想用镍柱纯化，做过纯化以后，跑胶发现有杂带，而且峰小，蛋白表达量可能是一方面原因，我怀疑是有一部分没挂住，样品处理有问题！我想问一下，表达上清需要如何处理才能上样，我直接过0.45um膜上样效果不好，还有样品ph会有很大影响吗？需要和洗脱液ph一样吗？我的上清ph是5左右，洗脱液为不同浓度的咪唑！用teis—hcl 8.0和nacl，不同浓度咪唑配制！能不能有人给一个上清处理和纯化的详细方案！谢谢呀！

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骚白

3人参与回答

沙哑情话随笔

，化工研发 2019-03-08回答

你的上清pH太低了，结合能力稍差的会直接不结合的，需要调节pH为弱碱性；当然酵母发酵发酵上清有一定的离子强度的，但为了尽量减少非特异吸附，通常Balance buffer为缓冲体系+300 or 500 mM NaCl，尽量调节发酵上清的离子轻度与其一致（不一致也可以，可能会影响最终的纯度及介质的载量）；Ni column的洗脱方式通常为Imidazole或pH

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三分满分

，销售 2019-03-08回答

通常酵母表达的蛋白也许是糖基化后标签暴露不充分，普通的镍柱都很难吸附，无论是IDA还是NTA的都难挂，作用力更弱的如TEP配基的更挂不上，需要配基密度高，作用更强的专门用于酵母表达系统的填料。

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眼泪的错觉

，实验室主任 2019-03-08回答

1. His-tag标签亲和纯化时结合通常为弱碱性环境（7-8之间），另外需要一定的离子强度减少非特异性结合，可以通过Imidazole浓度或低pH洗脱

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