背景及概述^[1]

大肠杆菌经过特殊处理后可以摄取外源DNA，这种状态下的细胞被称为感受态细胞。Shuffle T7-K12菌株是一种适用于T7启动子启动的蛋白表达的大肠杆菌菌株。该菌株中的DsbC酶不仅有利于正确形成蛋白的二硫键，还具有分子伴侣的功能，可以帮助不含二硫键的蛋白正确折叠。此外，Shuffle T7-K12菌株还具有降低基因背景表达的lac阻遏蛋白，以及抗T1噬菌体感染的特性。经过特殊工艺制作的Shuffle T7-K12感受态细胞的转化效率大于10^6 cfu/μg DNA。

基因型^[1]

F'lac, pro, lacIQ / (ara-leu)7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1?(phoA) PvuII phoRahpC*galE(orU) galKλatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) trxB rpsL150(StrR) gor (malF)3

菌株抗性^[1]

Shuffle T7-K12菌株对氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素敏感，对链霉素和壮观霉素具有抗性。

质粒转化步骤^[1]

1. 将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入1-5μl含有1-100ng的质粒DNA到细胞中，用手指拨打管底，轻轻混匀；

2. 冰水浴中放置30分钟，不要晃动；

3. 42℃热击60秒钟，不要晃动；

4. 冰水浴中放置2分钟，不要晃动；

5. 加入500μl的室温的SOC或LB培养基；

6. 置于30℃摇床中，150-200rpm，复苏培养60分钟；

7. 取50-100μl菌液涂布在含有抗性的LB平板上。待液体吸干后，倒置平板30℃培养12-24小时。

（平板划线分离法：复苏培养结束后，12000rpm离心30秒钟，弃掉上清，留100μl左右的液体，用200μl吸头轻轻吹打散菌块，取10μl重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大的单克隆菌落。）

（质粒快速转化步骤：将步骤2的时间缩短到5分钟，对于氨苄青霉素抗性的质粒，步骤4完成后，可直接涂布或划线于含抗生素的平板上。其它抗性的质粒仍需40-60分钟的复苏培养。）

蛋白表达步骤^[1]

1. 挑取单菌落，接种到含有抗生素的LB培养基中；

2. 在30℃，200rpm的条件下震荡培养细菌至对数生长期（OD600=0.4-0.8）；

3. 加入IPTG到终浓度为0.4mM，30℃诱导4小时或16℃诱导过夜；

4. 诱导完成后，离心收集菌体，用合适的方法（如考马斯亮蓝染胶法、Western-Blot法或酶活性分析法）分析菌体裂解物的总蛋白、上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况（可溶性或不溶性表达）；

5. 当需要大量表达重组蛋白时，可将10ml过夜培养物转接到1L培养基中，当培养到OD600=0.4-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，30℃诱导4小时或16℃诱导过夜（不同蛋白表达的最佳条件有所不同，需在实验中优化）。

主要参考资料

[1] Shuffle T7-K12 感受态细胞说明书