目前,农兽药残留已对我国食品安全造成严重威胁。其中,磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)是一种常见的药物残留物。为了检测SDM的存在,目前常用的方法是酶联免疫分析。然而,现有的免疫载体存在一些问题,如亲和力较差、易被肾脏系统消除以及潜在的安全隐患。因此,寻找一种新型的非动物源性免疫载体成为了未来的发展趋势。
本研究提出了一种新型的免疫载体——大豆11S球蛋白酸性亚基。该亚基具有稳定的结构和较强的水溶性,在有机溶剂存在的条件下能与半抗原交联,制备出的抗体具有良好的亲和力和高灵敏度。与免疫动物的亲缘关系较远,大豆11S球蛋白酸性亚基能够有效降低阳性克隆筛选的难度和工作量,并避免潜在的病毒传播风险。
本研究采用以下步骤制备磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原:
(1) 将0.05mmol的磺胺间二甲氧嘧啶小分子与26.26mg的EDC-HCl混合,加入无水N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解,得到A液。将5mg的载体蛋白溶于0.02M、pH=7.4的PBS中,得到B液。
(2) 将A液缓慢滴加到B液中,在室温下搅拌反应4~6小时,然后在4℃冰箱过夜。
(3) 将反应产物在pH=7.4的PBS缓冲溶液中透析3天,得到纯化的磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原,测定其浓度,分装后在-20℃保存。
此外,本研究还提供了大豆11S球蛋白酸性亚基的制备方法:
(1) 将大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl缓冲液,加入β巯基乙醇,调节混合溶液的浓度至0.015mol.L-1,pH值为8.0,在90℃条件下水浴30分钟。
(2) 收集除去碱性亚基的上清液,调节pH至5.0,在4℃、6500r·min-1条件下离心20分钟分离沉淀,再调节pH至中性,经冷冻干燥后即得到大豆11S球蛋白酸性亚基。
综上所述,本研究成功地利用大豆11S球蛋白酸性亚基作为新型免疫载体,与磺胺间二甲氧嘧啶连接形成人工抗原,并制备出了高亲和力的单克隆抗体。这一研究为农兽药残留检测提供了新的解决方案。