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IP为什么要加IgG做阴性对照?

从手中的书和文献中并没有看到,IP实验为什么要用IgG做阴性对照。

IP的方法是,如果测B是否和A有相互BINDING,那么固定细胞、裂解细胞、离心并提取蛋白后,加入抗A的一抗,然后加入抗一抗的珠子,然后离心,然后测蛋白浓度,然后western,然后在膜上加抗B的一抗,然后加抗这个一抗的二抗,然后显影。

问题一,我上述方法是否表述正确?问题二,如果上述所有一抗均为来源于兔的,那么对照用的IgG是否必须是正常兔的?是否是直接从公司买的?问题三,IgG在哪一步加入,替代了什么?谢谢!


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2人参与回答
,销售 2019-03-09回答
实验组:加入anti-A的抗体…………最后用Western检验B蛋白。对照组(阴性对照):加入IgG…………最后用Western检验B蛋白。
,副矿长 2019-03-09回答
如果你的实验没有问题,那么出来的结果应该是:实验组:能看到较亮的B的Western条带。说明B能与A结合。(B与A结合,用Anti-A沉淀A蛋白,也就把B蛋白也一起沉淀下来了,因此Western能检测到。)阴性对照组:看不到B蛋白的Western条带 或者 条带较弱。 (因为IgG并不能特异性的与任何蛋白结合,那么IgG所带下来的蛋白都是非特异性的与IgG结合的蛋白,得到的东西就是背景。)简言之:anti-A的抗体由特异性的识别A蛋白的Fab片段和IgG片段组成。但是anti-A抗体有可能有非特异性结合,这些就是背景。而IgG的阴性对照的引入就是为了消除这个背景。如果实验结果正确,那么“实验组”的条带应该比“阴性对照组”亮很多。
 
 
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