背景[1-3] SHZ-88大鼠乳腺癌细胞源自DMBA诱导的大鼠乳房癌。大多数细胞是上皮细胞样的，也可以见到巨大细胞团和病态有丝分裂；电镜下可见细胞表面和桥粒上有微丝。第3天的有丝分裂指数是59%。移植到同源动物中可以成活。培养基；90%RPMI-1640+10%胎牛血清+1%双抗。 SHZ-88大鼠乳腺癌细胞 细胞处理步骤： 1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 传代方法： 1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。 2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。 4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 应用[4][5] 用于经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣对在体乳腺癌SHZ-88细胞生长影响的研究 在大鼠带蒂腹壁浅动脉皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap,SIEA flap）模型的基础上,深入探讨慢病毒载体（Lentivirus,LV）介导外源基因增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）经动脉介入灌注转染复合组织瓣的可行性、安全性并对其转染条件作出评价,并首次将抗肿瘤因子白介素12与慢病毒载体结合,经动脉灌注于皮瓣中,转移于局部肿瘤创面,观察其抗肿瘤效果。 LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠SHZ-88乳腺癌细胞的影响行大鼠SHZ-88乳腺癌细胞皮瓣皮下接种法建立大鼠乳腺癌模型,将SD大鼠经动脉灌注液不同：LV-mIL12、LV-EGFP、PBS随机分为三组。按前文所述制备SIEA岛状皮瓣,经动脉灌注不同灌注液,分别于术后的第140天,观察负瘤鼠生长情况、SIEA皮瓣成活情况及局部瘤体生长情况。 结果显示：在术后的28天,ELISA检测实验组皮瓣中央及皮瓣周围均有mIL12表达,皮瓣中央处表达量>皮瓣周围>对照组。经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期（715天）抑制了局部肿瘤细胞的生长。但到第20天后肿瘤生长实验组与对照组基本持平,肿瘤体积不再明显长大。 综上所述,本实验建立了操作简便、稳定的大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注研究模型。证实慢病毒载体可以携带外源基因EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣。 通过三质粒包装法成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒,构建的LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞,并分泌有生物活性的mIL-12。LV-mIL-12经动脉灌注大鼠带蒂SIEA皮瓣,可以在皮瓣及其周围组织中表达。LV-mIL12转染的大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期（715天）抑制了局部肿瘤细胞的生长。 参考文献 [1]Lentiviral Transduction of Face and Limb Flaps:Implications for Immunomodulation of Vascularized Composite Allografts[J].Angelo A.Leto Barone,Zhao Y.Zhou,Michael W.Hughes,Ryan Park,Ruth M.Schulman,Steven Lee,Evan N.Vidar,Travis L.Shiba,Erin L.Weber,Curtis L.Cetrulo.Plastic and Reconstructive Surgery.2012(2) [2]Recent advances in lentiviral vector development and applications.[J].Mátrai Janka,Chuah Marinee K L,VandenDriessche Thierry.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.2010(3) [3]Lentiviral Vectors in Gene Therapy:Their Current Status and Future Potential[J].David Escors,Karine Breckpot.Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis.2010(2) [4]Nonintegrating lentivector vaccines stimulate prolonged T-cell and antibody responses and are effective in tumor therapy.[J].Karwacz Katarzyna,Mukherjee Sayandip,Apolonia Luis,Blundell Michael P,Bouma Gerben,Escors David,Collins Mary K,Thrasher Adrian J.Journal of virology.2009(7) [5]崔雅宁.经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣对在体乳腺癌SHZ-88细胞生长影响的研究[D].北京协和医学院,2012.