本文将讲述如何用化学法和生物法合成5-甲基尿苷，旨在为研究人员提供合成5-甲基尿苷的新思路。

背景：5-甲基尿苷是核苷与脱氧核苷药物的重要中间体。核苷和脱氧核苷是由核苷碱基分别和核糖或脱氧核糖以苷键形式而构成的,它们是组成核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的基本元件,是遗传基因的基础。核苷和脱氧核苷系列衍生物具有多种生物活性物质,可以直接或间接地作为药物使用,在治疗多种重大疾病方面起着重要作用。国外已经研究开发出系列化药物并商品化,国内研究与开发较晚,发展前景广阔。5-甲基尿苷是合成抗艾滋病药物齐多呋啶(AZT)、司他呋啶(d4T)和氟铁龙(5-脱氧氟尿苷)等一系列基因疗法药物的重要中间体。随着人们生活水平的不断提高,生命科学基因药物研究的不断深入,大力发展5-甲基尿苷及其衍生药物具有较好的社会效益和经济效益。

合成：

1. 化学法：

胸腺嘧啶与六甲基二硅胺烷反应生成双三甲硅基胸腺嘧啶，再和四乙酰核糖缩合反应后经醇解反应制备5-甲基尿苷。具体实验步骤如下：

（1）双三甲硅基胸腺嘧啶（2）的合成

在带有回流冷凝器、搅拌和温度计的250 mL 四口烧瓶中，加入胸腺嘧啶（1）63.0 g（0.5 mol），六甲基二硅胺烷128 mL（0.6 mol），硫酸铵3.0 g 混合搅拌,加热回流至溶液变澄清,约4 h，常压蒸去大部分未反应的六甲基二硅胺烷，减压蒸馏，收集馏分126℃~129℃/18 mmHg，得到无色透明的液体（2）126.2 g，自然冷却后凝固,收率93.5%。

（2）5-甲基尿苷（5）的合成（含缩合和醇解两步）

缩合反应:在带有恒压滴加漏斗、搅拌和温度计的500 ml四口烧瓶中，加入四乙酰核糖（3）18.0 g(0.057 mol),1，2-二氯乙烷200 mL,双三甲硅基胸腺嘧啶（2）16 g(0.059 mol)，冰盐浴冷却至 0℃后,加入或滴加入所需的路易斯酸催化剂，控制反应温度,保温12 h后取样分析。若反应不完全，则继续保温至完全。然后搅拌下加入饱和碳 酸氢钠溶液200 mL,分去水层,再用100 mL水洗后分层,蒸掉溶剂,得到金黄色稠状物三乙酰5-甲基尿苷（4）。

醇解反应:用甲醇150 mL溶解上述产物（4）通氨或加入甲醇钠催化剂,50℃~60℃搅拌下反应，HPLC检测跟踪,反应完全后,蒸去溶剂,重结晶精制后得到5-甲基尿苷（5）。5-甲基尿苷熔点：183．0℃～184．5℃。

2. 生物法：

上官俊龙等人用乙酰微小杆菌（Exiguobacterium acetylicum）完整细胞作为酶源，催化鸟苷和胸腺嘧啶合成5-甲基尿苷。 实验方法如下：

2.1 培养基和摇瓶培养

（1）培养基

斜面培养基（g/L）：牛肉膏5，酵母浸粉10，蛋白胨10，NaCl 5，琼脂20，pH7.0；平板培养基（g/L）：牛肉膏5，酵母浸粉10，蛋白胨10，NaCl5，琼脂20，pH7.0；发酵培养基（g/L）：牛肉膏5，酵母浸粉10，蛋白胨10，NaCl5，pH7.0；生物转化液：50 mmol/L 磷酸缓冲液，pH值8.0。斜面培养：37℃，24 h；平板培养：37℃，48 h；发酵培养：37℃，24 h；

（2）摇瓶培养

用无菌水洗下斜面种子，制成浓度为107~10 8 个/mL的菌悬液，以3 g/L的接种量接入发酵培养基中，37℃、180 r/min振荡培养24 h。将培养液于10 000 r/min离心10 min，弃去上清液。菌体用50 mmol/L 磷酸盐（pH值8.0）洗涤2~3次，所得菌体作为酶源冷藏备用。

2.2 转化体系

在10 mL的反应液中，以50 mmol/L鸟苷和50  mmol/L胸腺嘧啶为底物。磷酸缓冲液pH8.0浓度为 50 mmol/L。反应液中加入菌体量为50 g/L。转化： 60℃，120 r/min，8~10 h。

2.3 分析检测方法

酶反应完成后，于100℃ 水浴中加热5 min，10 000 r/min 离心10 min，上清液稀释100倍，用高效液相色谱（Waters 996）作定量分析。HPLC 分析检测条件：液相柱，YWG C18；流 动相，甲醇∶水= 10∶90（体积比）；波长，254 nm；流速，1.2 mL/min；常温检测。

结果：研究采用紫外诱变方法获得高表达核苷磷酸化酶菌种，使5-甲基尿苷的转化率提高到了75.8%；对培养基进行了碳源和氮源的优化，结果表明，3 g/L葡萄糖、20 g/L玉米浆、4 g/L NH4Cl有利于菌体生长；通过响应曲面（Response Surface Methodology, RSM）法获得了较为合适的转化条件：0.03 g/L MnSO4加入到pH值为8.0的磷酸缓冲液，两种底物浓度均为67 mmol/L， 反应温度为56℃。

参考文献：

[1]吴嘉圣. 5-甲基尿苷的合成 [J]. 浙江化工, 2013, 44 (03): 17-19.

[2]上官俊龙,苏境坦,郑桂兰等. 乙酰微小杆菌生物合成5-甲基尿苷的研究 [J]. 广东海洋大学学报, 2011, 31 (04): 30-36.

[3]高飞飞, 治疗艾滋病医药中间体5-甲基尿苷合成技术. 浙江省, 浙江先锋科技有限公司, 2010-08-23.