背景信息^[1-3]

小鼠成纤维细胞L929是一种贴壁生长的小鼠上皮样成纤维细胞。该细胞系是在1948年3月建立的NCTC clone 929（小鼠结缔组织）的克隆株。细胞系L是最早建立的连续培养细胞系之一，而clone 929是最早的克隆株。亲本细胞系L是从一只100日龄的雄性C3H/An小鼠的皮下网眼状空隙和脂肪组织中建立的。经过毛细管法分离单细胞，第95代的细胞系L建立了clone929。经检测，该细胞系不含鼠痘病毒。

L929细胞图示

L929（小鼠成纤维细胞）常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）

1.吸出原培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液润洗细胞两次，加入1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶进行消化（注意消化时间，通常控制在1~2分钟）。

2.在镜下观察消化情况，当细胞边缘收缩并贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮），去除胰酶，加入6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量将细胞层吹落和散开。

3.将部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适量的完全培养基，放入培养箱中培养。

4.注意培养基的pH值变化情况，定期换液，当细胞密度达到70-80%时，进行传代或冻存。

应用研究^[4][5]

不同浓度D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞L929增殖和凋亡的影响研究

前期实验已经证实在特定浓度（50-150mM）下的D-缬氨酸（D-valine, D-val）能有效抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成，有望将其应用于控制生物膜感染的治疗。

因此，明确其生物安全性并筛选出安全浓度范围的D-缬氨酸对于其可能作为抑制生物膜形成或/和分散已形成的生物膜的制剂，治疗种植体周围炎具有重要意义。

研究方法： 1.培养小鼠成纤维L929细胞，观察细胞形态和生长状态，并绘制生长曲线。 2.实验组分别加入不同浓度的D-val，对照组加入等体积的DMEM培养液。在第1、3、5天使用CCK-8法检测不同浓度的D-val对成纤维细胞L929增殖活性的影响。 3.实验组分别加入D-val后培养5天，收集细胞，使用Annexin V FITC/PI双染和流式细胞术检测细胞凋亡情况。 4.实验组分别加入D-val后培养5天，使用Quantitative Real-time PCR技术检测各组细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3的相对表达量。 5.使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，并进行单因素方差分析。

研究结果： 1.CCK-8法检测结果显示，在第1、3、5天三个时间点，实验组的细胞吸光度值均低于未加入D-val组。实验组细胞的增殖活性下降，并且下降的趋势与D-val浓度相关，即随着D-val浓度的增加，细胞增殖活性下降越明显。当D-val浓度在100-150mM时，细胞的增殖活性受到明显抑制，并且结果具有统计学差异（P<0.05）。 2.加入D-val培养5天后，流式细胞仪检测显示实验组中L929细胞的凋亡率均值低于正常组细胞。

参考文献

[1]A retrospective study on 1592 consecutively performed operations in one private referral clinic.Part II:Peri‐implantitis and implant failures[J].Torsten Jemt DDS,PhD,Michel Karouni DDS,Jérémy Abitbol DDS,Ons Zouiten DDS,Hadi Antoun DDS.Clinical Implant Dentistry and Related Research.2017(3)

[2]An Up to 12‐Year Retrospective Follow‐Up on Immediately Loaded,Surface‐Modified Implants in the Edentulous Mandible[J].Stefan Vandeweghe DDS,PhD,Peter Hawker DDS,MSc,Hugo De Bruyn DDS,MSc,PhD.Clinical Implant Dentistry and Related Research.2016(2)

[3]Molecular mechanisms of antimicrobial tolerance and resistance in bacterial and fungal biofilms[J].Heleen Van Acker,Patrick Van Dijck,Tom Coenye.Trends in Microbiology.2014

[4]Mitochondria in Apoptosis:Bcl-2 Family Members and Mitochondrial Dynamics[J].Jean-Claude Martinou,Richard J.Youle.Developmental Cell.2011(1)

[5]崔云霞.不同浓度D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞L929增殖和凋亡的影响[D].吉林大学,2019.