重组无机焦磷酸酶是一种具有催化作用的酶，能够将一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子。这种反应具有高放能性，因此可以驱动一些热力学上不利的转化进行到完全。该酶在脂代谢、钙吸收、骨形成和DNA合成等生物过程中扮演着重要角色。

重组无机焦磷酸酶的特性

(1) 具有专一性的水解焦磷酸根的能力。

(2) 活性强、稳定性高且成本低。

重组无机焦磷酸酶的作用

在镁离子存在的情况下，重组无机焦磷酸酶能够将无机焦磷酸水解为2分子磷酸根。它可以在RNA体外合成或DNA聚合过程中水解生成的副产物焦磷酸，从而解除焦磷酸对反应的抑制，显著增加RNA或DNA的合成量。

重组无机焦磷酸酶的应用

(1) 用于RNA的体外合成。

(2) 防止DNA聚合过程中焦磷酸的累积。

(3) 在SNP分型实验中防止焦磷酸的污染。

在生物体内，核酸的合成会产生焦磷酸盐，而焦磷酸酶可以分解焦磷酸盐，避免其累积对生物体产生负面效应。然而，在PCR反应中，焦磷酸的累积同样会降低扩增效率并影响荧光染料的稳定性。

为了解决这个问题，人们添加无机焦磷酸酶到PCR反应中，将焦磷酸水解为正磷酸，从而增加反应混合液的pH值并提高荧光染料的稳定性。然而，由于PCR反应的高温要求，这种焦磷酸酶必须能耐受95℃的高温。

为了满足这一要求，研究人员重组表达了嗜热栖热菌HB27株的PPase基因，该酶具有较高的热稳定性。基于这个基因，构建了一种改造的热稳定无机焦磷酸酶，可以应用于需要更多循环数和反应时间的超敏PCR扩增，从而提高扩增效率。这种热稳定无机焦磷酸酶具有增强DNA复制的特点，并且在100℃加热4小时后仍具有100%的活性。

制备热稳定无机焦磷酸酶的方法是将原酶的氨基酸序列进行改造，改造后的酶具有更高的热稳定性。具体的改造方法包括改变氨基酸T为S、E为K、L为I或V为I、D为A、A为Q或K等。通过人工合成对应的碱基序列，扩增构建表达载体，并进行蛋白纯化。

参考资料

[1] CN201710017276.4 一种改造的热稳定无机焦磷酸酶

概述^[1]

无机焦磷酸酶（PPA）基因是植物糖代谢过程中的蔗糖合成调控基因，为将该基因运用于甘蔗转基因的研究，从面包酵母克隆了该基因。无机焦磷酸酶（酵母）纯化自重组 E. coli 菌株，携带有从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克隆的 ppa 基因和蟾分枝杆菌（Mycobacterium xenopi）GyrA 内含肽的融合基因。该焦磷酸酶催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐：P207-4 + H20 →2HP04-2。在核酸扩增实验中，其可解除生成的无机焦磷酸盐对反应体系的抑制。由 Biohelix 公司（现在是 Quidel 公司的全资子公司）研发。无机焦磷酸酶（英语：Inorganic Pyrophosphatase，简称为焦磷酸酶）是一种催化一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子的酶。这是一个高放能的反应，因此此反应可偶联到一些热力学上不利的转化，以便驱动这些转化进行到完全。此酶的功能乃是在脂代谢（包括脂合成与分解）、钙吸收以及骨形成和DNA合成中扮演重要角色，其他生物化学转化也是如此。

组分

应用

无机焦磷酸酶可用于反转录反应中提高 RNA 产量，以及增强 DNA 复制。

活性定义

活性定义为在标准反应条件下（20mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM MgCl2，2mM PPi，25℃ 反应 10 分钟），每分钟催化无机焦磷酸盐生成1μmol 磷酸盐所需的酶量。

储存

该酶可在-20℃保存3年。

使用注意事项

1. 该酶在多种反应Buffer中均具有活性，通常可直接接入HDA扩增、LAMP扩增等实验中。

2. 该酶的用量在不同的实验中需要优化，通常在0.05~1U/ml浓度调整。

3. 该酶的最佳反应温度为25℃，其在16~37℃均有活性，但65℃ 10min可使该酶失活。

主要参考文献

[1] 范海阔, 黄东杰, 刘巧泉, 等. 无机焦磷酸化酶融合基因克隆分析及表达载体的构建[J]. 西南農業學報, 2007, 20(6): 1267-1271.