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橘子是只喵~

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westernblot小白第一次跑出来的拍照结果不是单一条带？ 推荐一个网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验文章，可以搜索相关的看看查看更多

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生物医学工程

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tunel法检测细胞凋亡？文章转自：英格恩生物技术博客 TUNEL方法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-地高辛配基切口标记）源自完整固定的细胞核DNA 裂解部位标记（如Gavrieli et al. 1992)。该法可用于组织切片、玻片上细胞生长、流式细胞计量术分析，用于组织切片的改进程序由Naik 及其合作者提出(Naik et al. 1996) ，叙述如下 1、组织切片的TUNEL 染色 1）取下组织，立即用新制备的4％甲醛固定，室温过夜。用多聚甲醛(EM 级）制备4％的甲醛溶液，在100 ml 水中加8g 多聚甲醛，在通风橱中加热至50 ~ 60℃．加几滴1 moL/L NaOH 使固体全部溶解。多聚甲醛全部溶解后，将溶液放冰上，迅速冷却至室温。加100 ml 2 的2 x PBS, 过滤固定液。甲醛储存液应在每次实验前新配。 2) 通过50% 、70%、80% 、95% 、100％乙醇和100% 二甲苯系列孵育（每步5 分钟）使组织脱水 3) 用石蜡包埋组织，制备5μm厚的切片，固定于玻片上，将石蜡切片70℃加热10分钟或58 ~ 60℃加热30 分钟去除石蜡 4) 通过以下溶液进行系列转移水合切片：二甲苯5 分钟2 次， 96％乙醇3 分钟2 次，然后90% 、80% 、70% 、50 ％，双蒸水各3 分钟 5) 在冷的4％甲醛中后续固定切片5 分钟，用pH7.2 的PBS 清洗3 次，每次5 分钟 6) 室温下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 处理玻片10 分钟，用PBS 清洗3 次 7) 用0.5%H 2 O 2 的PBS 溶液室温处理20 分钟，封闭内源过氧化物酶活性。 8) 用补充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反应缓冲液(GIBCO/BRL）预孵育切片。每个切片上加27 μl 溶液，用已裁成合适大小的Parafilm 膜覆盖。 5x TdT 反应缓冲液 500 mmol/L 二甲胂酸钾， pH7.2 l0 mmol/L CoCl 2 l mmol/L DTT 9) 室温孵育10 分钟后，取下Parafilm 膜，用纸巾吸去水。 I0) 在用TdT 反应缓冲液制备的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL; 15 U/ml), 2 – 4 μmol／L地高辛配基偶联的dUTP 中孵育切片，再用Parafilm 膜覆盖切片， 37℃ 湿室中30 分钟～ 1 小时。用pH7.2 的PBS 将切片洗3 次。 11) 用5 U/ml 辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛孵育玻片，用Parafilm 膜覆盖。37℃ 温室中孵育30 分钟 l2) 应用快速DAB 底物(Sigma) ，用DAB 和H 2 O 2 处理检测标记细胞。用过量水清洗切片。可用甲基绿复染切片30 秒。用过量水清洗。 13) 通过用二甲苯终洗2 次的系列乙醇使切片脱水。用Permount 或Entallan介质固定，用光学显微镜分析注意事项 TUNEL 阳性核被染成深棕色。如需要，在DAB 反应中可加人硫酸镍(3 mg/ml) 。可以增强染色，阳性核将呈现紫／黑色。 TUNEL 染色的流式细胞计量术分析 1) 凋亡诱导之后， 200 g 离心5 分钟收集1×10 6 悬浮细胞，用冷的PBS 洗2次，重复离心 2) 用2 ml 2 ％的甲醛PBS 溶液(pH7.2，用多聚甲醛新配）固定细胞沉淀，室温下在水平摇床上孵育30 分钟。 3) 200 g 离心5 分钟沉淀细胞，用PBS 洗1 次。重复离心。 4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 ％柠檬酸钠溶液4℃ 孵育2 分钟透化细胞，用PBS 洗2次。 5) 在温室中于TdT 缓冲液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二钾胂酸钠）中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl 2 、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小时，进行TUNEL 反应，终体积50 μl 6) 37℃孵育1 小时后，加人2μl 0.5 mol/L EDTA 终止反应，用pH7.2 的PBS 将细胞洗2次。用带有氩激光(488 run) 的流式细胞计量仪(FACScan, Becton Dickinson) 分析数据。或者，可将细胞重悬于50μl 液体固定介质如FluoroGuard (Bio-Rad) 中，移到载玻片上，盖上盖玻片、用荧光显微镜分析。注意事项 FACSsean 对TUNEL 标记的定量分析最好用于淋巴细胞，对贴壁细胞如成纤维细胞效果不够好贴壁细胞的TUNEL 染色 1) 用无菌镊子将一无菌盖玻片放入35 mm 培养皿中 2) 将大约1×10 4 细胞接种于无菌盖玻片上，培养24 ~ 48 小时。凋亡诱导时，细胞铺满不超过80% ，如细胞贴壁不太好，可以用纤连蛋自、聚赖氨酸或血清预处理盖玻片，以使细胞更好地贴壁生长 3) 诱导凋亡后，用pH7.2 的PBS 轻轻洗细胞1 次，不要除去垂死细胞，用冰冷的甲醇（- 20℃）固定10 分钟 4) 室温空气干燥玻片5 分钟，在pH7.2 的PBS 中温育10 分钟重新水合 5) 按上述方法进行TUNEL 反应。将合适的Parafilm 膜放入温室，膜上加50μl TdT反应混合液，放盖玻片，细胞朝下在反应液上。37℃ 孵育1 小时 6) 从温室中取出盖玻片，放回35 mm 培养皿中。用PBS 洗细胞3 次，用固定液(Bio-Rad) 固定到载玻片上查看更多

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细胞污染双球菌，怎么办? 推荐一个网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看。查看更多

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上清电泳一直没有条带，然而后续纯化却有目的条带，求解答？ 推荐一个网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看。查看更多

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请问细胞是被什么污染了? 推荐一个网站给你，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，之前在这个网站上看到过关于细胞污染的，你可以搜索看看。查看更多

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WB求助？ 推荐一个网站给你，上面有很多实验内容，WB的也有，可以搜索看看。英格恩生物技术博客查看更多

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求助Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳跑小分子量蛋白！总是“皱眉”条带？ 推荐一个我常会看的网站给你，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看。查看更多

#SDS-PAGE

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细胞培养问题？ 推荐一个网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验干货，可以去看看。查看更多

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求助，蛋白条带跑散了怎么办？ 推荐一个好用的网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实用的实验内容，可以去看看查看更多

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蛋白电泳跑不出条带连杂带都没有，但maker可以跑出来？ 推荐一个我常用的网站给你，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看。根据关键字搜索就会有相关的内容查看更多

#maker

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小白一枚，求助？ 推荐一个我常用的网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看。查看更多

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关于siRNA沉默GFP？ 推荐一个我常用的网站吧，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，你可以去搜索看看有没你需要的。查看更多

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工艺技术

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求助有关PCR反应？ 推荐一个网站给你，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看查看更多

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蛋白电泳条带跑起来是斜的是什么原因呀? 推荐一个网站给你，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看查看更多

#蛋白电泳

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求助 WB跑很久了现在只能出现这样的条带有什么好办法吗？出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. 目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等。可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。 5. 目的蛋白降解。重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。 6. 发光液质量问题，可选用发光清晰的ECL发光试剂，如Enlight 发光液等。查看更多

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ELISA结果数据的处理？之前在英格恩生物技术博客上看到一篇文章，推荐给你。这年头谁还不会做ELISA，可以去看看https://www.engreen.cn/2015/06/%e8%bf%99%e5%b9%b4%e5%a4%b4%e8%b0%81%e8%bf%98%e4%b8%8d%e4%bc%9a%e5%81%9a%e4%b8%aaelisa/ 查看更多

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WB目的蛋白跑到非预测位置？ 没遇到过这个问题~不过可以推荐你一个网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，可以去看看。https://www.engreen.cn/ 查看更多

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DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳？ 没遇到过这个问题，推荐你一个网站，英格恩生物技术博客，上面有很多实验内容，你可以搜索看看。https://www.engreen.cn/ 查看更多

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慢病毒质粒293t转染效率很高但是感染效率很低，何故? 可以使用英格恩的慢病毒感染增强试剂。https://www.engreen.com.cn/product/%e6%85%a2%e7%97%85%e6%af%92%e6%84%9f%e6%9f%93%e5%a2%9e%e5%bc%ba%e8%af%95%e5%89%82/ 查看更多

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有关HEPG2 转染问题请教？可能有多种原因：目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡；转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害；细胞贴壁转染之后没有正常换液。建议：考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统；摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试Entranster转染试剂。对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考虑添加一些血清来帮助细胞恢复健康。查看更多

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