TCEP盐酸盐，即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，是一种三价磷系衍生物，具有优异的作用效果。它是一种无色、无味、易溶于水的弱还原性物质，其水溶解度可达到310mg/mL。与空气和水溶液相比，TCEP在温度和浓度变化下的稳定性较高。TCEP是一种非常适用的二硫键还原试剂，具有极强的选择性，几乎没有与其他氨基酸发生副反应，而且可以在更宽的pH范围（包括酸性条件，pH值为3）下使用，从而有效减少酰胺键的水解。TCEP的反应活性温和，易溶，毒性小，操作更加方便，且在酸性和碱性溶液中都具有良好的稳定性。此外，相比于DTT，TCEP的还原能力更强，更稳定，其作用可以维持2~3周，是被广泛认可的DTT的良好替代物。

性质

2.1溶解度

TCEP盐酸盐的分子量为286.65，在水中的溶解度为310g/L，相应的摩尔浓度为1.08mol/L。由于其为盐酸盐结构，因此在各个pH值的水溶液条件下都具有良好的溶解度，便于制备各种浓度的水溶液。然而，在常规的有机溶剂如甲醇、乙醇中，TCEP盐酸盐的溶解度非常小。

2.2溶液稳定性

TCEP盐酸盐在酸性和碱性水溶液中都相对稳定。将TCEP盐酸盐直接溶解于水中，水溶液的pH值大约为2.5。研究表明，在配置成100mMol/L的盐酸、氢氧化钠或其他类型的缓冲溶液后，室温保存24小时（缓冲液清单见下表1），有效成分几乎没有减少。几周后的检测结果显示，仅约有20%的TCEP盐酸盐被氧化失效。

2.3有效还原pH值范围

相较于DTT，TCEP盐酸盐可以在较宽的pH范围内还原二硫键[1]。实验表明，在pH=1.5-9.0的范围内，只需30秒即可完全还原二硫二吡啶。当pH>9.0时，仅有50%的二硫二吡啶被还原。与DTT相比，在溶液pH<8.0时，TCEP盐酸盐的还原性更强，甚至可以还原氧化态的DTT。

2.4有效还原浓度

通常情况下，使用相对过量的TCEP盐酸盐，以5-50mMol/L的浓度，在室温条件下几分钟内即可完全还原多肽或蛋白中的二硫键。Han的实验结果表明，使用30uMol/L浓度的TCEP盐酸盐，在pH=1.5-8.5的范围内，大约40分钟即可完全还原二硫二吡啶。如果仅使用等当量的TCEP盐酸盐，则需要更长的时间才能完全还原。Mery的报道中指出，使用1:1当量的TCEP盐酸盐完全还原二硫键大约需要1小时。

2.5使用范围

（1）由于TCEP盐酸盐中不含硫结构，其还原反应液无需额外提纯，可直接用于含有马来酰亚胺或交联试剂的溶液。一般情况下，TCEP盐酸盐浓度小于10-20mMol/L可直接用于含有马来酰亚胺的化学反应。

（2）50mMol/L的TCEP盐酸盐溶液可作为DTT或2-巯基乙醇的替代试剂，但TCEP盐酸盐需要在溶液中才能发挥作用，因此不适用于等电聚焦电泳（IEF）。

（3）当涉及到在免疫球蛋白铰链区还原二硫键的抗体标记时，需要同时还原重链和轻链。这种特殊还原操作通常使用2-巯基乙胺。Blauenstein证实了TCEP盐酸盐也可用于这种特殊还原操作。将3.8-4.0mMol/L的TCEP盐酸盐溶液加入到10mg/ml的免疫球蛋白中，使用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，缓冲溶液的pH大约为4.6-7.5，在室温下20-30分钟即可将二硫键还原，通过脱盐柱可以去除TCEP盐酸盐还原副产物。

参考文献

[1].Levison, M.E., et al. (1969). Reduction of biological substances bywater-soluble phosphines: Gamma-globulin. Experentia25:126-7.

[2].Han, J.C., et al. (1994). A procedure for quantitative determination oftris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable andeffective than dithiothreitol. AnalBiochem220:5-10.

[3].Mery, J., et al. (1993). Disulfide linkage to polyacrylic resin for automatedFmoc peptide synthesis. Immunochemical applications of peptide resins andmercaptoamide peptides. Int J PeptideProtein Res42:44-52.

[4].Blauenstein, P., et al. (1995). Experience with theiodine-123 and technetium-99m labeled anti-granulocyte antibody Mab47: acomparison of labeling methods. Eur JNuclear Med22:690-8.