如何培养和传代H125细胞

培养和传代人非小细胞肺癌H125细胞的关键在于维持其贴壁生长特性、使用合适的培养基（RPMI 1640 + 10% FBS）并在细胞密度达80%–90%时按1:2至1:6比例进行传代。
一、细胞培养条件与准备
培养基：推荐使用 ?RPMI 1640 培养基?，添加 ?10% 胎牛血清（FBS）? 和 ?1% 双抗（青霉素-链霉素）?，以支持细胞生长并预防污染 。
培养环境：置于 ?37℃、5% CO?、湿度70%–80%? 的恒温培养箱中培养 。
容器处理：使用T25或T75培养瓶，确保瓶盖拧松以便气体交换，尤其在运输后复苏时更需注意 。
二、细胞复苏操作流程
将冻存管从液氮中取出，立即放入 ?37℃水浴锅中快速摇晃解冻，直至冰晶完全融化。
用75%酒精消毒冻存管外壁，转入超净台内。
将细胞悬液转移至含 4–6 mL 完全培养基的离心管中，1000 rpm 离心 3–5 分钟，弃上清。
用 1–2 mL 新鲜培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，补足至6–8 mL培养基，放入培养箱过夜。
第二天观察细胞贴壁情况，确认无污染后正常换液继续培养 。
三、细胞传代操作步骤（贴壁细胞）
当细胞融合度达到 ?80%–90%时进行传代：
弃去旧培养液，用不含钙镁离子的 ?PBS 缓冲液润洗1–2次?，去除残留血清。
加入 ?0.25%胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 消化液（T25瓶加1–2 mL），37℃孵育 1–2分钟。
显微镜下观察，待细胞 变圆、间隙增大 后，立即加入含10% FBS的培养基终止消化。
轻轻吹打瓶壁，使细胞完全脱落形成单细胞悬液。
将悬液 1000 rpm 离心 3–5 分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬。
按 1:2 至 1:6 比例 分装至新培养瓶中，补加6–8 mL完全培养基，37℃继续培养 。
注意：吹打力度要轻柔，避免产生气泡损伤细胞；传代频率建议每周2–3次，视生长速度调整。
四、细胞冻存方法
细胞生长良好时，按传代步骤收集细胞，离心后弃上清。
用 ?冻存液（90% 完全培养基 + 10% DMSO） 重悬细胞，调整密度为 1×10?–1×10? 个活细胞/mL。
分装至冻存管（1 mL/管），标注细胞名称、代数、日期。
放入 ?程序降温盒，-80℃过夜，次日转入液氮长期保存 。