牛痘病毒拓扑异构酶的原核表达与纯化方法是什么?

拓扑异构酶是一种催化DNA拓扑异构体转变的酶，可以改变DNA的连环数。拓扑异构酶分为Ⅰ类和Ⅱ类，其中Ⅰ类可以将双链超螺旋DNA转变成松弛环状DNA，每次反应增加1个连环数；Ⅱ类可以将松弛环状DNA转变成超螺旋形DNA，每次作用减少2个连环数，也被称为促旋酶。牛痘病毒拓扑异构酶I(VTopoI)是一种简单、分子质量最小的I型拓扑异构酶，存在于病毒内，由314个氨基酸残基构成，基因大小仅有945bp。

为了获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶，研究人员建立了原核表达体系及纯化方法。首先，优化并人工合成了牛痘病毒拓扑异构酶的全基因序列，然后构建了牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)，并将其转化到E.coliBL21Star(DE3)菌株中。接着，优化了诱导表达条件，最佳诱导条件为30℃下以0.5mmol/LIPTG诱导12小时。通过Talonhis-tagpurificationresin螯合层析柱纯化，使用SDS-PAGE鉴定纯化效果，并借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。结果显示，转化pET28a/TOPO的E.coliBL21Star(DE3)成功表达了牛痘病毒拓扑异构酶蛋白，经钴离子螯合层析柱纯化后，其分子质量为36ku。酶切和冻融试验结果表明，该酶具有高活性和高稳定性。因此，成功构建了牛痘病毒拓扑异构酶的原核表达和纯化体系，为后续拓扑异构酶的应用研究奠定了基础。

主要参考资料

[1] 协和医学词典

[2] 牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达与纯化