PCR反应引物长度如何设置？

引物长度

一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度最重要的因素就是引物的长度。引物的退火温度一般选择引物的（Tm值-5℃），有的直接用Tm值。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

在利用软件设计引物的时候，可以通过TM值反过来决定引物的长度，特别是荧光定量PCR的引物，要控制TM=60℃左右。