如何培养大鼠血管内皮细胞? 大鼠血管内皮细胞(RAOEC)是从成熟细胞系中获得的,并经过永生化处理制成传代细胞株。经过五代传代后,细胞活力仍然高于95%。 细胞培养步骤 在开始培养之前,需要准备培养基和培养冻存条件: 1)培养基的配制:使用10%的北美胎牛血清和1%的双抗。 2)培养条件:气相为空气和二氧化碳的混合物,比例为95%和5%。温度保持在37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。冻存液的配制为90%血清和10%的DMSO,并将其储存在液氮中。 细胞处理 1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管放入37℃水浴中迅速解冻,并加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中,在过夜的条件下进行培养(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,进行过夜培养)。第二天进行液体更换并检查细胞密度。 2)细胞传代:当细胞密度达到80%-90%时,可以进行传代培养。对于贴壁细胞,可以按照以下步骤进行传代:弃去培养上清液,用不含钙和镁离子的PBS润洗细胞1-2次。 1. 在培养瓶中加入2mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA),放入37℃培养箱中消化1-2分钟。然后在显微镜下观察细胞的消化情况,如果细胞大部分变圆并脱落,迅速将培养瓶拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入少量培养基终止消化。 2. 加入6-8mL培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。 3. 将细胞悬液按照1:2到1:5的比例分配到新的含有8mL培养基的新皿或瓶中。 RAOEC在糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖中的作用 miR-98靶向Cyclin D2抑制糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖的机制研究 通过建立2型糖尿病大鼠模型,并利用Real-time PCR检测miR-98在糖尿病大鼠血管内膜组织中的表达,发现miR-98的表达明显低于正常大鼠组织。进一步的Western blotting检测发现,Cyclin D2在糖尿病大鼠血管内膜组织中的表达明显高于正常大鼠组织,并且与Cyclin D2相关的p-Rb的表达也升高。细胞水平的MTT实验结果显示,高糖处理组细胞的增殖率明显高于低糖处理组。此外,高糖处理组的细胞主要进行分裂增殖,而正常组的细胞主要停滞在G1期。通过Real-time PCR和Western blotting检测发现,高糖处理组的miR-98表达低于低糖处理组,而Cyclin D2和与其相关的p-Rb的表达在高糖处理组中明显高于低糖处理组。 参考文献 [1] Role of MicroRNAs in Prostate Cancer Pathogenesis[J]. You-Lin Wang, Shuai Wu, Bo Jiang, Fu-Fen Yin, Shuai-Shuai Zheng, Si-Chuan Hou. Clinical Genitourinary Cancer. 2015(4) [2] Role of microRNAs-29b-2, 155, 197 and 205 as diagnostic biomarkers in serum of breast cancer females[J]. Olfat Shaker, Moataz Maher, Yasser Nassar, George Morcos, Ziad Gad. Gene. 2015(1) [3] Oxidative stress and its association with TNF-α-308 G/C and IL-1α-889 C/T gene polymorphisms in patients with diabetes and diabetic nephropathy[J]. Brijesh Dabhi, Kinnari N. Mistry. Gene. 2015(2) [4] Circulating Micro-RNAs as Diagnostic Biomarkers for Endometriosis: Privation and Promise[J]. Warren B. Nothnick, Ayman Al-Hendy, John R. Lue. The Journal of Minimally Invasive Gynecology. 2015(5) [5] 李新新. miR-98靶向Cyclin D2抑制糖尿病大鼠血管内皮细胞增殖的机制[D]. 滨州医学院, 2015. 查看更多