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层析技术讲义？层析技术讲义层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。一、层析的基本理论层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。对于一个层析柱来说，可作如下基本假设： 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n: n = 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。 3.1.3 层析的基本概念 1. 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2. 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。 3. 分配系数及迁移率（或比移值）：分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式： lnK = G0/RT) D －( 式中： K为分配系数（或平衡常数） G0为标准自由能变化 D R 为气体常数 T为绝对温度 C, ° G0 为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20 D 这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的 K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。 4. 分辨率（或分离度）分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法： ⑴ 使理论塔板数N增大，则Rs上升。 ① 增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。 ② m以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分离的效率大大提高了。 m m ；而HPLC柱子的固定相颗粒为10 m 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100 ③ 采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于气相色谱，流速影响相当大。 ⑵ 改变容量因子D（固定相与流动相中溶质量的分布比）。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对提高Rs不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在1 £ D £ 10 ，最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温（一般降低温度），改变流动相的性质及组成（如改变pH值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等），或改变固定相体积与流动相体积之比（如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些），提高D值，使分离度增大。 a （分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比），使Rs变大。实际上，使 a ⑶ 增大 a 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 a 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，的变化对Rs影响最明显。总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。 5. 正相色谱与反相色谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。 6. 操作容量（或交换容量）在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。它的单位是毫摩尔（或毫克）/克（基质）或毫摩尔（或毫克）/毫升（基质），数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。 3.1.4 层析法的分类层析根据不同的标准可以分为多种类型: 1. 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。 2. 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。 3. 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。 3.1.5 柱层析的基本装置及基本操作目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。 1. 柱层析的基本装置 2. 柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤： ⑴ 装柱柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50；凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N~1N）、碱（0.5N~1N）、盐（0.5M~1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装柱法在此省略。） ⑵ 平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。 ⑶ 加样加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。 ⑷ 洗脱当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种。洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。 ⑸ 收集、鉴定及保存在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。 ⑹ 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。 3.2 凝胶层析 3.2.1 简介凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。 3.2.2 凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi 设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现Ve Vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。 > 柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。 2. 分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。 3. 排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。 4. 分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。 5. 吸水率和床体积吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。 6. 凝胶颗粒大小层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（m）来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100－200目。 3.2.4 凝胶的种类和性质凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶（dextran）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（agarose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。 1. 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是指由天然高分子－葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）乘以10。如Sephadex ~ 的主要型号是G-10 105。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的pH一般为为2－10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 ´ G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为6 C下40 ° min 对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。 Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N, N’-methylenebisacrylamide）交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。 Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl稳定工作的pH一般为 3~11。另外Sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。 2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad Bio-Gel ~ Laboratories 生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。各种型号的主要参数如附表所示。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel 105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pH为1~10之间比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，所以吸附效应较小。另外，聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。 ´ P-300 为4 3. 琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的多糖链。它在100 C时呈液态，当温度降至45 ° C以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有Pharmacia ° 4B ）和Bio-Rad Laboratories生产的Bio-gel ~ Biotech 生产的Sepharose（2B A等。关于各种琼脂糖凝胶的基本参数如附表所示。琼脂糖凝胶在pH为4－9之间是稳定的，它在室温下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以0－30 C为宜。 ° ~ Sepharose 与2,3二溴丙醇反应，形成Sepharose CL型凝胶（CL-2B CL-4B），它们的分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范围内应用，稳定工作的pH范围为3－13。Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。 4. 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供，商品名为Ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围， 5. 多孔硅胶、多孔玻璃珠 104塔板 ´ 多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义，它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶，它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长，无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以达到4 / 106。它们的最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时pH应小于8.5。 ´ 103 －9 ´ 106 ，多孔玻璃珠一般为3 ´ 米。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，所以柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽，多孔硅胶一般为102－5 另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快，目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化学物理稳定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析；而Superose的分离范围很广，分辨率较高，可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。关于各种凝胶产品的详细情况可以参阅本书附录以及各个公司的产品目录。 3.2.5 凝胶的选择、处理和保存 1. 凝胶的选择通过前面的介绍可以看到凝胶的种类、型号很多。不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都有较大的差别，所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝胶，这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围，根据分离范围来选择合适型号的凝胶。一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离（group separations）和分级分离（fractionations），分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。在分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶，这样分离效果好。一般常用排阻极限较小的凝胶类型。分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类型，凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量，另一方面要合适，不能过大。如果分离范围选择过小，则某些组分不能得到分离；如分离范围选择过大，则分辨率较低，分离效果也不好。选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验条件下都可以正常的工作。如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作参数，选择合适的类型的凝胶。 2. 凝胶的处理凝胶使用前要首先要进行处理。选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（ml）/ 凝胶的床体积（ml / g）。由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10％－20％。葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化，不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限较小的凝胶）膨化时间较短，在20 C条件下需十几个到几十个小时，如Sephadex ° C 条件下需3－4小时；但吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大的凝胶）膨化时间则较长，20 ° G-100以上的干胶膨化时间都要在72小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在1－5小时即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。 3. 凝胶的保存凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠，4 C下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50％的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95％乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60 ° C烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。 ° 3.2.6 凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作步骤与前面介绍的柱层析的操作过程基本相似，这里就不再重复了。下面主要介绍凝胶层析操作中应注意的一些具体问题。 1. 层析柱的选择层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。 2. 凝胶柱的鉴定凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。 3. 洗脱液的选择由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。 4. 加样量关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过（Ve1－Ve2）。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。 5. 洗脱速度洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm / hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的，各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以选择最合适的实验条件。 3.2.7 凝胶层析的应用前面介绍了凝胶层析的基本理论以及基本实验操作，下面简单介绍一下凝胶层析在生物学方面的应用。 1. 生物大分子的纯化凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。 2. 分子量测定前面已经介绍了，在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。 Kav＝－b lg MW＋c Ve＝－b’ lg MW＋c’ 由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶层析测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。 3. 脱盐及去除小分子杂质利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。 4. 去热源物质热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。 5. 溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。 3.3 离子交换层析 3.3.1 简介离子交换层析（ Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC ）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 1848 年， Thompson 等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪 40 年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。 50 年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 3.3.2 基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为： + + Y + ) A - X ¾ ( R Û + + A + ) Y - X ¾ 阳离子交换反应： ( R ( Û - + A - ) Y + X ¾ 阴离子交换反应： ( R - + Y - ) A + X ¾ R + 和 X - 其中 R 代表离子交换剂的高分子聚合物基质， X - 和 A + 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子， A - 和 Y + 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团， Y 分别代表溶液中的离子基团。从上面的反应式中可以看出，如果 A 离子与离子交换剂的结合力强于 Y 离子，或者提高 A 离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使 A 离子将 Y 离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。 + 各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、 pH 、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、 pH 等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为： Li < + Na < + K < + Rb < + ； Na + Cs < + Ca2 < + Al3 < + Ti4 。蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及 pH 有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的 pH 条件下，等电点 pI < pH 的蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点 pI > pH 的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般 pI 越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。 3.3.3 离子交换剂的种类和性质 1. 离子交换剂的基质离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。以纤维素（ Cellulose ）、球状纤维素（ Sephacel ）、葡聚糖（ Sephadex ）、琼脂糖（ Sepharose ）为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质，葡聚糖离子交换剂一般以 Sephadex G － 25 和 G － 50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以 Sepharose CL － 6B 为基质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。 2. 离子交换剂的电荷基团根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 OH - PO2H ）为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基（ - PO3H2 ）和亚磷酸基团（ - SO3H ），如磺酸甲基（简写为 SM ）、磺酸乙基（ SE ）等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团（ - 阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的 pH 范围，强酸型离子交换剂在较大的 pH 范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的 pH 范围则较小，如羧甲基在 pH 小于 6 时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团（ COOH ），如羧甲基（ CM ）为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对 H 离子的结合力比 Na+ 离子小，弱酸型离子交换剂对 H 离子的结合力比 Na+ 离子大。 - ）或羧基（离子大。 ¾ 离子的结合力比 Cl ¾ 离子小，弱酸型离子交换剂对 OH ¾ 离子的结合力比 Cl ¾ NHCH3 ）、伯胺（ -NH2 ）等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（ DEAE ）为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对 OH - N(CH3)2 ）、仲胺（ - N(CH3)3 ），如季胺乙基（ QAE ）为强碱型离子交换剂，结合叔胺（ - 阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团（ 3. 交换容量交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。另一些影响因素如实验中的离子强度、 pH 值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般 pH 对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在 pH 较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的 pH 时，电荷基团不易解离，交换容量小。同时 pH 也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的 pH 以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（ meq / mg 或 meq / 充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。 + ，再用标准浓度的 NaOH 滴定生成的 HCl ，就可以计算出离子交换剂的交换容量；对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将 H + 。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用 NaCl 充分置换出 H + ml ）来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用 HCl 处理，使其平衡离子为 H 对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示，一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。 3.3.4 离子交换剂的选择、处理和保存 1. 离子交换剂的选择离子交换剂的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换剂。首先是对离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的 pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为 4 ，稳定的 pH 范围为 6 － 9 ，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。强酸或强碱型离子交换剂适用的 pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端 pH 下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。其次是对离子交换剂基质的选择。前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和 pH 变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。 m ）来表示，目数越大表示直径越小。前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。所以大颗粒的离子交换剂适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换剂适于需要高分辨率的分析或分离。 m 另外离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数（ mesh ）或者颗粒直径（这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以 DEAE- 纤维素（二乙基氨基纤维素）和 CM- 纤维素（羧甲基纤维素）最常用，它们在生物大分子物质（蛋白质，酶，核酸等）的分离方面显示很大的优越性。一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多；二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子交换纤维素已成为非常重要的一类离子交换剂。 2. 离子交换剂的处理和保存离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为 Na 型（即平衡离子是 Na 离子），阴离子交换剂为 Cl 型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是 HCl ，碱是 NaOH 或再加一定的 NaCl ，这样处理后阳离子交换剂为 Na 型，阴离子交换剂为 Cl 型。使用的酸碱浓度一般小于 0.5 mol / L ，浸泡时间一般 30 min 。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。前面介绍的酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用 HCl 处理可将其转为 Cl 型，用 NaOH 处理可转为 OH 型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。前面已经介绍了，离子交换层析就是通过离子交换剂上的平衡离子与样品中的组分离子进行可逆的交换而实现分离的目的，因此在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是 H 或 OH 离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用 H 或 OH 型离子交换剂，因为分离过程中 H 或 OH 离子被置换出来都会改变层析柱内 pH 值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。 C 下保存。 ° 离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并加入适当的防腐剂，一般加入 0.02 % 的叠氮钠， 4 3.3.5 离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。 1. 层析柱离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为 1:10 到 1:50 之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。 2. 平衡缓冲液离子交换层析的基本反应过程就是离子交换剂平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和 pH 的选择对于分离效果有很大的影响。平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和 pH 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。 3. 上样离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和 pH 值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的 1 － 5 ％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。 4. 洗脱缓冲液在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变 pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变 pH 的洗脱，对于阳离子交换剂一般是 pH 从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 从高到低。由于 pH 可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了，可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。 5. 洗脱速度洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。 6. 样品的浓缩、脱盐离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。 3.3.6 离子交换层析的应用离子交换层析的应用范围很广，主要有以下几个方面。 1. 水处理 + 离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过 H - 型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过 OH 型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。 2. 分离纯化小分子物质离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在 pH 2~3 上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和 pH ，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。 3. 分离纯化生物大分子物质离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。 3.4 亲和层析 3.4.1 简介亲和层析（ Affinity Chromatography ）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。直到 60 年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。 3.4.2 亲和层析的基本原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的 Sepharose － 4B 等。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。前面介绍的一些层析方法，如吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分离。由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。 3.4.3 亲和吸附剂选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。这里主要介绍一些基本的原理，关于活化、偶联等过程的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考书。 1. 基质 ⑴ 基质的性质基质构成固定相的骨架，亲和层析的基质应该具有以下一些性质： 1) 具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的 pH 、离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改变。 2) 能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质和配体的基本性质。 3) 基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体结合。 4) 基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用。一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定性和均一性也较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。琼脂糖凝胶则基本可以较好的满足上述四个条件，它具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用，如 Pharmacia 公司的 Sepharose － 4B 、 6B 是目前应用较多的基质。 ⑵ 基质的活化基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。 1) 多糖基质的活化前面已经介绍了，多糖基质尤其是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多，下面介绍一些常用的活性基团及活化方法。 ① 溴化氰活化溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（ NH2 ）反应，主要生成异脲衍生物。溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的 pKa ＝ 10.4 ，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。通过实验条件的不断改进，这些缺点可以得到一定程度的控制。 ② 环氧乙烷基活化这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。如在含有 NaBH4 的碱性条件下， 1 ， 4 －丁二醇－双缩水甘油醚的一个环氧乙烷基可以与羟基反应，而将另一个环氧乙烷基结合在基质上。另外也可以用环氧氯丙烷活化，将环氧乙烷基结合在基质上。这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的 N － C 、 O － C 和 S － C 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件， pH 为 9~13 ，温度为 20~40 C 。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。 ° 上面两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如： N －羟基琥珀酰亚胺（ NHS ）活化、三嗪（ triazine ）活化、高碘酸盐（ periodate ）活化、羰酰二咪唑（ carbonyldiimidazole ）活化、 2,4,6 －三氟 5 －氯吡啶（ FCP ）活化、乙二酸酰肼（ adipic acid dihydrazide ）活化、二乙烯砜（ divinylsulfone ）活化等，总之，目前对基质的活化方法很多，各有其特点，应根据实际需要选择适当的活化方法。 2) 聚丙烯酰胺的活化聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。 3) 多孔玻璃珠的活化对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺－玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。 ⑶ 间隔臂分子在亲和层析中，由于配体结合在基质上，它在与待分离的生物大分子结合时，很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质，而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的 “ 间隔臂 ” ，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物 NH2 (CH2)n R 共价结合到活化的基质上， R 通常是氨基或羧基， n 一般为 2 － 12 。例如 Pharmacia 公司生产的 AH － Sepharose 4B 和 CH － Sepharose 4B 就是分别将 1,6 －乙二胺， 6 －氨基乙酸与 CNBr 活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。另外也可以通过进一步的活化处理，生成 N －羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团直接与各种配体偶联。引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。 2. 配体 ⑴ 配体的性质亲和层析是利用配体和待分离物质的亲和力而进行分离纯化的，所以选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的。理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。 2) 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。 3) 配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。 4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。完全满足上述条件的配体实际上很难找到，在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（ specific ligand ）和通用性配体（ general ligand ）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。解决这一问题的方法是使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（ lectine ）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合 RNA 、结合 RNA 的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。在后面的亲和层析应用中将详细介绍实验中各种常用的配体。 ⑵ 配体与基质的偶联除了前面已经介绍了基质的一些活化基团外，通过对活化基质的进一步处理，还可以得到更多种类的活性基团。这些活性基团可以在较温和的条件下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫醇基等多种配体反应，使配体偶联在基质上。另外通过碳二亚胺、戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联。以上这些方法使得几乎任何一种配体都可以找到适当的方法与基质偶联。关于配体和基质偶联的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考文献。配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用 2 －乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种： 1) 差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法还是相当准确的。 2) 直接光谱测量：对于能够吸收 250nm 以上波长的配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。 3) C 下与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。 ° 凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如 75 4) 酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。 5) 2,4,6 －三硝基苯磺酸钠（ TNBS ）分析：利用 TNBS 与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色，可以计算出配体结合量 6) 元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通过元素分析就可以确定配体结合量。 7) 放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一种非常灵敏的方法。影响配体结合量的因素很多，包括基质和配体的性质、基质的活化方法及条件、基质和配体偶联反应的条件等等。例如通常溴化氰活化的基质的活性基团比环氧基活化的基质多，配体结合量可能较大。在用溴化氰活化时，增加溴化氰的量及反应的 pH ，可以增加基质上活化基团的量，从而增大配体结合量。偶联过程中增加配体的量及增大反应的 pH ，也可以增大配体结合量。实验中通常希望配体结合量较高，但应注意增加配体结合量应根据实际情况，还要考虑到其它因素的影响。因为提高配体的结合量不等价于提高亲和吸附剂的吸附容量，配体结合量只是影响亲和吸附剂吸附容量的一个因素，还有很多因素，如基质、配体以及待分离物质本身的性质，配体在基质的结合情况以及后面要介绍的实验操作条件等都可能对亲和吸附剂的吸附容量产生很大的影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构，降低配体和待分离物质的亲和力，这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的，各种因素的影响都不是绝对的，要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素，并通过实验摸索来选择合适的条件。目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售，可以省去基质活化，配体偶联等复杂的步骤。使用方便，效果好，但一般价格昂贵。关于这些产品的具体情况，可参阅本书后面的参考文献或相关的产品介绍。 3. 亲和吸附剂的再生和保存亲和吸附剂的再生就是指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法使去除吸附在其基质和配体（主要是配体）上结合的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力。一般情况下，使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情况下，尤其是当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。但如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处理时不能改变配体的活性。 C 下保存。也可以加入 0.5% 的醋酸洗必泰或 0.05% 的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。 ° 亲和吸附剂的保存一般是加入 0.01% 的叠氮化钠， 4 3.4.4 亲和层析的基本操作亲和吸附剂选择制备后，亲和层析的其它操作与一般的柱层析基本类似。下面主要介绍亲和层析过程中的一些注意事项。 1. 上样亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常 10cm 左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、 pH 、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。 2. 洗脱亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。 ⑴ 特异性洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择 NAD+ 进行洗脱， NAD+ 是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与 NAD+ 结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。 ⑵ 非特异性洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液 pH 、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的 pH 、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的 pH 、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。 3.4.5 亲和层析的应用亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。 1. 抗原和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为 10 8 － 10 - 12M ，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力，以便于洗脱。 - 另外金黄色葡萄球菌蛋白 A （ Protein A ）能够与免疫球蛋白 G （ Ig G ）结合，可以用于分离各种 Ig G 。 2. 生物素和亲和素生物素（ biotion ）和亲和素（ avidin ）之间具有很强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强，其解离常数为 10 15M ，洗脱通常需要强类的变性条件，可以选择 biotion 的类似物，如 2-iminobiotin 、 diiminobiotin 等降低与 avidin 的亲和力，这样可以在较温和的条件下将其从 avidin 上洗脱下来。另外，可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用，通过生物素与亲和素的亲和力，胰岛素就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与 CNBr 活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物素与 NHS 生成的酯）作用结合上生物素，并且不改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。 - 3. 维生素、激素和结合转运蛋白通常结合蛋白含量很低，如 1000 升人血浆中只含有 20 毫克 Vit 7 － 10 - B12 结合蛋白，用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力（解离常数为 10 16M ）而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强，所以洗脱时可能需要较强烈的条件，另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。 - 4. 激素和受体蛋白激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（ 10 6 － 10 - 12M ）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。 - 5. 凝集素和糖蛋白 -D- 甲基葡萄糖苷洗脱。同样，用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。 a -D- 甲基甘露糖苷或 a -D- 吡喃葡萄糖苷的糖蛋白，麦胚凝集素可以特异的与 N- 乙酰氨基葡萄糖或 N- 乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白 A 、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。如洗脱伴刀豆球蛋白 A 吸附的蛋白可以用 a -D- 吡喃甘露糖苷或 a 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。如伴刀豆球蛋白 A 能结合含 6. 辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括 AMP 、 cAMP 、 ADP 、 ATP 、 CoA 、 NAD+ 、 NADP+ 等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。 7. 多核苷酸和核酸利用 poly-U 作为配体可以用于分离 mRNA 以及各种 poly-U 结合蛋白。 poly-A 可以用于分离各种 RNA 、 RNA 聚合酶以及其它 poly-A 结合蛋白。以 DNA 作为配体可以用于分离各种 DNA 结合蛋白、 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。 8. 氨基酸固定化氨基酸是多用途的介质，通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力，或者通过氨基酸的疏水性等性质，可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如 L －精氨酸可以用于分离羧肽酶， L －赖氨酸则广泛的应用于分离各种 rRNA 。 9. 染料配体结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料 Cibacron Blue F3GA 是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与 NAD+ 相似的空间结构，所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、 DNA 聚合酶等具有亲和力，可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有 Procion Red HE3B 等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用，使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。 10. 分离病毒、细胞利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强，所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如 Pharmacia 公司生产的 Sepharose 6MB ，颗粒大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层析。 11. 金属螯合色谱金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸（ IDA ）等螯合剂，它能与 Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 等作用，生成带有多个配位基的金属螯合物，可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如 Cu2+ － IDA 配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。 12. 共价色谱共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基－ Sepharose 、巯丙基－ Sepharose 等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次重复使用。 13. 疏水色谱疏水色谱是指利用固定的疏水配体和蛋白质疏水表面区域之间的相互作用而进行分离的。例如用各种烷胺作为配体与基质结合，用于分离糖元磷酸化酶 b 等。一、纸层析　　　纸层析创立于1944年，和薄层层析一样，纸层析不仅可以用来分离、检识、测定中药中复杂的有效成分，而且可以于少量成分的提取精制。它是一种以滤纸上吸附的水为固定相，滤纸作为支持剂的分配层析法。纸层析应用较广，其主要用途是为分配薄层及分配柱层析摸索条件。虽然纸层析比较费时，易产生拖尾、不耐腐蚀性显色剂等，但它对水溶性或亲水性强的成分分离却有独到之处。因而，今天我们对它作以研究。　　1．纸层析的分离原理：作为一种分配层析，纸层析是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的。纸层析通常多以水为固定相，滤纸为载体。点样后，先饱和，再浸入适当的展开剂中进行展开。　　2．滤纸的选择：常用层析专用滤纸，纯净无杂质，有一定强度；同时还须质地均匀、平整无折痕，根据样品及展开剂的要求来选择下列各型滤纸：　　（1）快速滤纸结构巯松，宜用来分离Rf值相差较大的成分。　　（2）慢速滤纸结构致密，宜用来分离Rf值相差较小的成分。　　（3）中速滤纸比较常用。　　滤纸可用二甲基甲酰胺、丙二醇代替水做固定相，以分离亲脂性较强的成分；或者选择不同PH的缓冲液处理，以分离一些酸、碱性成分。　　基本选择依据还是三相关系图。主要以被分离成分在两相溶剂中溶解度的不同，以及展开剂的极性来进行统一协调和考虑。　　3．展开剂的选择：　　用的展开剂是与水能部分相溶的有机溶剂，如用水饱和的正丁醇、正戊醇、酯等。　　有时也向其中加入有机酸、有机碱或一定比例的甲醇、乙醇等。以增大Rf值。　　如欲分离极性较大的成分，可在展开剂中加入适量的水、乙醇等。　　4．纸层析的理想结果：斑点圆正、集中；被分离成分的Rf值在0.05－0.85之间；分离后各成分间的距离以Rf值计算，最好大于0.05。　　5．纸层析的操作步骤：　　（1）点样：将样品溶解于溶解度大且易挥发的有机溶剂。以毛细管或专业点样器　吸入样品溶液进行点样。注意常规距离：板端留2cm、样点之间留2cm。课堂活动：演示讲解纸层析的点样方法。　　（2）展开：层析所用容器与TLC基本相同，专用纸谱筒或大试管也被常用。纸层析的展开方式除了TLC中的所有方式外，还可采用径向展开。详见P37。展开结束（溶剂前沿至全纸长3/4处）后，取出滤纸，用铅笔画出溶剂前沿位置（防止干燥后溶剂前沿消失）。　　（3）显色：干燥后的滤纸，采用先看（日光下看）、再照（紫外灯下照）、再喷（需要时喷上显色剂）的步骤进行显色。注意画出斑点位置。 Rf值的计算方法与薄层层析相同。　　（4）纸层析的应用：　　二、柱层析：在柱型容器中进行的层析　　一般可用材料有聚丙烯（或其它可用塑料）、有机玻璃、玻璃等做成的柱或柱型、筒形物体；内径从2cm－10cm不等，柱高等于内径的10－20倍；下端不能有吸附剂或固定相、载体流出。　　柱层析的基本步骤：　　1．装柱：可有湿法装柱和干法装柱等两种方法。装柱时，干法装柱与湿法装柱大同小异：吸附剂均经漏斗进入；干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，干燥的吸附剂从上端缓缓进入，前者加入空柱底，后者进入了流动相（即课本中的溶剂或者洗脱剂）。　　装柱要领：柱层析的装柱比较重要，装柱的效果直接影响层析分离效果。因此，是制备性分离的一种基本操作技能。但是，只要做到密实均匀无气泡就大功告成。　　小技巧：万一装柱时带入气泡，可从上端压入大量溶剂将气泡从下端挤出。　　2．加样:又称上样或样品上柱。多将样品溶于少量的溶剂（注：柱层析所用的洗脱剂）中，小心的加入层析柱项端的平面内；也可将样品与易挥发溶剂混合后，再与吸附剂吸收、挥干挥发性溶剂后，撒布于柱的上端；有时也可用多层园形滤纸吸收样品溶液，再平放到柱的上端。柱层析加样的基本要求是均匀薄饼样层。　　3．洗脱：柱层析所用的溶剂，习惯上称为洗脱剂。洗脱操作的目的当然是要将加入的样品中各个组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成分。洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收集是关键；下端烧杯定时换，薄层纸层化学检；洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。　　经验：每30分钟－1小时内流出的洗脱剂体积等于所用吸附剂的重量为宜。分配柱层析的特点：分配柱层析用支持剂装柱，常用的支持剂有纤维素粉、硅胶、硅藻土。装柱时先将固定相溶剂（如水或其他溶剂）加入支持剂中，搅拌混匀，再倾入的溶剂中，激烈搅拌，使两相互相饱和平衡，然后上柱。在层析柱中预先要加入已经用固定相溶剂充分饱和的流动相溶剂。铵一般湿法装柱，倒入上述处理后的支持剂，注意不断轻敲管壁，使均匀紧密，然后，放出调出柱面上的流动相。样品上柱及洗脱过程与吸附柱层析相同。分配柱层析所用的溶剂系统，可用相应的纸层析或分配薄层层析条件进行选择。 [NextPage] 干柱层析　　将干吸附剂（未与洗脱剂混合）装柱，设法将样品加到上面，从柱项加入洗脱剂，使洗脱剂往下移动至柱底，使待分离的成分层析、展开。早在20世纪初，干柱层析就有应用，但一直未被重视。后来由于寻找高效的制备性薄层的需要，人们发现干柱层析能在一根层析柱上迅速地进行制备性分离，分离效果与制备性薄层层析相似，可以将薄层层析的分离条件直接用于干柱层析，从而分离出更多量的化学成分。　　干柱层析有塑料膜柱和玻璃柱两类，塑料常为聚乙烯薄膜。目前，干柱层析已经广泛用于实验室制备性分离。其优点是：分离效率高，分离条件可用薄层摸索，如果直接套用薄层最佳的分离条件，即可得到与薄层基本相同的分离效果。　　聚酰胺层析　　聚酰胺材料简介：　　聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，聚酰胺又称锦纶、尼龙、种类繁多。层析常用的为锦纶－6和锦纶－66。其单体物质是已内酰胺、已二胺和已二酸。分子中的酰胺键是其结构的重要部分。酰胺键也是与其它极性键基团产生氢键的物质基础。　　聚酰胺层析的基本原理：聚酰胺层析属于吸附层析。酰胺键与物质分子中的极性键的相互作用应该是吸附作用的主要原因。值得一提的是分离物质的氢键作用是聚酰胺层析的根本原因，但有些事实说明，非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。故聚酰胺的薄层层析原理目前尚未完全阐明。　　六、离子交换层析　　定义：利用离子交换树脂（立体网状高分子化合物）做为固定相，流动相携带被分离的离子型化合物，在离子交换树脂上进行离子交换，从而达到分离及提纯的色谱法。　　网状结构的骨架部分简称网架，它的性质很稳定，对酸、碱及某些有机溶剂、氧化剂、还原剂都具有一定的稳定性，对热也比较稳定。在网架结构的骨架上，有许多可以与溶液中的离子起交换作用的活性基团，称作交换基。　　离子交换树脂的分子结构中，由两大部分构成：稳定的网架及网架上的交换基。　　（一）分类：根据交换基结合离子的性能不同将离子交换树脂分为两类：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂。每类中根据交换基（分析化学中称为功能基）的活性不同又分为强酸、弱酸型；强碱、弱碱型。　　（二）组成：离子交换树脂可由树脂母体和交换基团构成。常见的是聚苯乙烯树脂作为母体。相关结构图示略。　　（三）离子交换层析的原理：交换基上的活性离子（H+或OH-）在水溶液中与其它阴、阳离子的可逆交换来达到逐步分离的目的。　　当两种（或两种以上）不同的可交换物质离子通过离子交换树脂柱时，各不同成分的亲和力不同，在柱上的交换速度也不同，被洗脱的时间也就不同，从而达到分离目的。　　（四）离子交换树脂的性能：　　1．交联度：离子交换树脂中所含的交联剂的百分率。　　例如：上海树脂厂生产的聚苯乙烯强酸型阳离子交换树脂，从其产品牌号：　732（强酸1×7）可以得知，交联度为7%（1×7）。　　2．交换容量：单位质量的离子交换树脂中毫摩尔数。单位为mmol/g。　　交换容量是用来表示离子交换树脂进行交换离子的能力大小的，其数值大小决定于以树脂表面及网状结构内部所含的交换基的多少。　　3．溶胀性：指树脂吸收水分后，浸润膨胀能力的大小。　　操作步骤：离子交换层析法主要用于柱层析（也可用于薄层层析）。　　4．装柱：柱底垫玻璃丝或脱脂棉，将事先用水溶胀并洗涤干净的离子交换树脂（如果是新购商品一定要先进行预处理，详细操作见树脂的预处理与再生）与水的混合物灌入柱内。要求均匀、密实、无气泡。　　5．交换：在柱顶放置一层玻璃丝，下端徐徐放液，同时将样品溶液慢慢倒入柱内。　　注意：所加入的样品溶液中被交换成分的毫摩尔数，应与柱内所加的离子交换树脂的总容量相适应，经验比例为：加入量占总交换容量的阳1/2、阴1/4，1/3。具体换算详见交换容量。　　6．洗脱：用合适的洗脱剂从上端加入，使样品中各种不同的成分先后流出，分段定量收集洗脱液，可得单一成分的化合物。　　（五）树脂的预处理与再生：将含有可溶性小分子有机物和铁、钙等杂质的商品离子交换树脂中的上述杂质除去，同时将其盐型转化成可用的游离型处理过程。　　1．树脂的预处理：商品树脂浸泡在蒸馏水中1－2天（其间可滤过换水1－2次），将该溶胀后的树脂装柱，再根据交换类型进行不同处理。阴阳离子的处理　　方式分别如下：　　（1）阳离子交换树脂的预处理：　　钠型（又称盐型）→10倍量或20倍量1mol/L的HCI溶液转型交换→蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的NaOH恢复成钠型→蒸馏水洗→10倍量或20倍量1mol/L的HCI溶液再转型交换→再用蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的NaOH再次恢复→再次重复1次上述过程。最后成为H型。　　（2）阴离子交换树脂的预处理：　　氯型（又称盐型）→10倍量或20倍量1mol/L的NaOH溶液转型交换→蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的HCI恢复成氯型→蒸馏水洗→10倍量或20倍量1mol/L的NaOH溶液再次转型交换→再用蒸馏水洗至中性→10倍量的1mol/L的HCI再次恢复→再次重复1次上述过程。最后成为OH型。详见P46 　　2．树脂的再生：树脂长期使用，当它的交换基大部分已经交换了离子后，就会失去交换能力而失效，需要适当处理使交换基上的已交换离子了（如钙、镁离子等）变成可继续交换的游离型交换基离子（H＋及OH－）。这个过程叫离子交换树脂的再生。此再生过程可以进行多次，直至离子交换树脂的颗粒发生严重破损，不能再用为止。　　树脂再生的原理与预处理大体相同。　　葡聚糖凝胶层析　　中药化学成分分子大小各异，分子量从几十到几百万。可根据这一性质用透析法、凝胶过滤法，超滤法、超速离心法等分离中药化学成分。前两者是利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用；超滤法是利用因分子大小不同引起的扩散速度的差别；至于超速离心法则是利用溶质在超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性。以上这些方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作，对分离小分子化合物来说不太适用。可是凝胶过滤法可用于分离分子量在1000以下的化合物。　　凝胶过滤法分离物质的原理：凝胶过滤法为（gel filtration）也叫凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、排阻色谱（exclusion chromatography）,系利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用的载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后，装入色谱柱中，加入样品混合物，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部（即被排阻在外）而在颗粒间隙移动，并随溶剂一起柱底流出；小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增大、流速变缓，将较晚流出。　　样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入到凝胶颗粒内部的程序也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到支柱平衡后，即铵分子由大到小顺序先后流出并得到分离。　　凝胶的种类和性质：商品凝胶虽然很多，但常用的凝胶有如下两种：葡聚糖凝胶（Sephadex－G）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)。葡聚糖凝胶（Sephadex－G）只适于在水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质。羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)为葡聚糖凝胶（Sephadex－G－25）经过羟丙基化后得到的产物，除保留有Sephadex－G－25原有的分子筛特性，可铵分子量大小分离物质外，在由极性和非极性溶剂组成的混合物中常常起到反相分配色谱的作用，适用于不同类型有机物的分离，在中药化学成分的分离中得到了越来越广泛的应用。　　加压液相柱色谱　　经典的液－液分配柱色谱中用的载体（如硅胶）颗粒较大（100－150μm），流动相仅靠重力作用自上向下缓缓流过色谱柱，流出液用人工分段收集后再进行分析，因此柱效较低，费时较长。近年来，已经逐渐被各种加压液相色谱所代替。　　加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面均较大的球形硅胶微粒，如Zi-pax类薄壳型或表面多孔型硅球以及Zorbax类全多孔硅胶微球，其上键合不同极性的　有机化合物以适应不同类型分离工作的需要，因而柱效大提高。　　加压液相色谱铵加压强弱可以分为快速色谱（flash chromatography,约2.02×105Pa）、低压液相色谱（LPLC，＜ 5.05×105Pa＝、中压液相色谱（MPLC，5.05×105Pa－20.2×105Pa）及高压液相色谱（HPLC，＞ 20.2×105Pa）。　　加压液相色谱法作为一种现代分离分析方法，在中药有效成分研究中应用广泛。近来，中低压液相柱色谱装置及E.Merck公司生产的配套用Lobar柱因分离规模较大（可达克数量级）、分离效果好（有时不亚于HPLC所得结果）、分离速度较快（填充颗粒较大，约40－60μm）、分离条件可由相应的TLC结果直接选用、价格比较便宜、操作简便的特点，而很受用户欢迎。薄层色谱法标准操作规程 1 简述：薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。 2 仪器与材料： 2.1 玻板：除另有规定外，用 5cm ×20cm ， 10cm ×20cm 或 20cm ×20cm 的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。 2.2 固定相或载体：最常用的有硅胶 G 、硅胶 GF 、硅胶 H 、硅胶 HF254 ，其次有硅藻土、硅藻土 G 、氧化铝、氧化铝 G 、微晶纤维素、微晶纤维素 F254 等。其颗粒大小，一般要求直径为 10—40µm 。薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用 10—15% 煅石膏（ CaSO4·2H2O 在 140 ℃ 烘 4 小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（ 0.5—0.7% ）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液或缓冲液的薄层。 2.3 涂布器：应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。 2.4 点样器：常用具支架的微量注射器或定时毛细管，应能使点样位置正确集中。 2.5 展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。 3 操作方法： 3.1 薄层板制备：除另有规定外，将 1 份固定相和 3 份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为 0.2—0.3mm ），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在 110 ℃ 烘 30 分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。 3.2 点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边 2.0cm ，点样直径为 2——4mm ，点间距离约为 1.5—2.0cm ，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 3.3 展开：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边 0.5—1.0cm （切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为 10—15cm ），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。 4 注意事项： 4.1 所用玻璃板应洗净不挂水珠，光滑平整。 4.2 铺板要均匀，厚度适宜，并于室温下晾干后在 110 ℃ 活化 30 分钟，置于有干燥剂的干燥箱或干燥器中备用。 4.3 点样点一般为圆点，不能太大。查看更多 2个回答 . 5人已关注

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北京8月起强制使用低硫煤将有助减少环境污染-盖德化 ...？本帖内容由盖德化工转载自网络　　今年8月1日起，北京市将强制使用低硫煤，此举将减少燃煤对环境的污染，有助于改善北京空气质量。新修订的《低硫煤及制品》北京市地方强制性标准将自8月1日正式实施，新标准规定，北京市所有用煤企业(无论民用还是工业)都须使用低硫煤(京标煤)，硫的含量需要小于等于0.4%。“不符合本市地方标准的煤炭及制品将被禁止使用”，市质监局强调。　　民用煤须全部低烟尘　　市质监局相关部门负责人介绍，该标准对煤炭质量特别是关系环境污染的硫、挥发性有机物等指标，进行了严格控制，部分指标高于国家标准。　　其中，所有煤炭品种的全硫指标小于等于0.4%，优于国家特低硫煤分类指标，从源头控制燃煤二氧化硫的排放。工业用煤灰分指标小于等于12.5%，等同于冶炼精煤，保证热值的前提下减少固体污染物的排放；挥发分指标设立高限，限制高烟尘污染烟煤的使用。同时限定民用煤挥发分(Vdaf)指标小于等于12%，须全部为低烟尘污染排放的煤炭产品。　　此外，为满足环保要求，防止散料储存、运输、销售过程中产生大量的粉尘污染，还对民用煤(蜂窝煤除外)要求必须使用包装袋或包装箱包装，并对产品进行批次、生产日期等信息的标注。　　煤炭监管面临瓶颈　　市质监局通过排查确认，目前北京市煤炭销售、生产和用能单位共约2800余家，其中，煤炭生产企业209家，销售企业300家，具有一定规模的使用单位2300余家，无照经营的煤炭加工和经销点数百家。　　“煤炭生产经营和使用单位多、小、低、劣问题突出”，市质监局相关部门负责人说，目前煤炭生产经营企业无准入的许可要求，部分经营者甚至没有办理营业执照，煤炭生产经营企业数量多、规模小、水平低且生产经营活动季节性强、流动性大，　　“一台机器、几把锹、两三个人”的生产经营企业普遍存在，许多企业没有质量技术把关和控制管理能力。　　另外，民用煤的用煤结构不合理，原煤散烧现象突出。无烟原煤，也就是块煤，不仅成本高而且不易燃烧，百姓普遍反映不好用。还有，居民买煤的便利性不高，客观上给高硫高灰等不符合地方标准煤炭的存在留下了市场空间。　　用煤将全程监控　　据悉，市质监局与市新农办、市发改委、市环保局等部门建立了信息通报、联合执法的监管联动机制，2013-2014年采暖季期，农村地区优质煤替代工作中监督企业对不符合标准的2万吨煤炭进行了更换。据环保部门数据显示，2013-2014年采暖季期较上一年度采暖季，本市PM2.5浓度下降了10.6%。　　下一步，市质监局将继续加大对煤炭生产加工、销售和使用环节的监督，实现全过程的质量控制。各乡镇、村要依法采取有效措施，严禁非“京标煤”及其制品进村销售。　　市质监局表示，将引导企业做到生产有规模、供应有能力、质量有保障、营销有信誉。建立并推行检验、进货验收和销售台账、合同、公示制度、包装标识等五项制度，实现煤炭质量的可追溯。同时，落实配送环节的质量保障，各网点建立煤炭进货的索票制度和出货登记制度，对于进货的蜂窝煤，必须索要企业出厂的该批次检验合格报告，对于进货的其他型煤和块煤，必须有包装标识和检验合格证，同时做好进货记录，从而形成从生产供应企业到配送，最终到用户的全链条的质量保障。(记者杨滨)查看更多 0个回答 . 5人已关注

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2013年金阀门奖大赛、铂金管道奖大赛及论文大赛开赛通知？金阀门奖大赛 2013 年金阀门奖会授予在鹰图化工 - 电力 - 海事应用软件方面，最具创新性和最具执行力的选手。获奖者可以赢得1000美金奖金并获得 2013年Hexagon国际用户大会的免费注册机会！获奖者将在 2013年Hexagon国际用户大会上宣布，本次大会将于2012年6月4日至7日在美国拉斯维加斯举办。所有参赛作品需于 2013 年 4 月 8 日前提交 - 现在就开始准备吧！点击浏览更多信息。铂金管道奖大赛通过您 Smart 3D 和 SmartPlant® 二维设计解决方案的自动化创意来赢取大奖吧！ 2013年铂金管道奖大赛将关注SmartPlant®3D 和 SmartMarine® 3D、 SmartPlant P&ID、SmartPlantElectrical，以及SmartPlant Instrumentation中最具创新性的自动化创意。获奖者将在2013年海克斯康国际用户大会上被授予荣誉，本届大会将于2013年6月3日至6日在美国拉斯维加斯举办。获胜者将得到2000美金奖金并且获得免费注册2013年Hexagon国际用户大会的资格！所有参赛作品必须于 2013 年 4 月 2 日前提交 —— 现在就着手准备吧！点击浏览更多信息。除此之外，鹰图中国2013年论文大赛也正式开赛：论文大赛鹰图公司大中华区论文大赛于 2013 年 1 月再次启动。上届的大赛吸引了众多专业人士参与，影响力逐渐扩大。而本次活动将延续鹰图公司 PP&M 论文大赛的宗旨：展现用户学习能力和科研能力及实现成果。希望各单位、专家能够积极参与，您也可以根据自身项目成果，进一步总结提炼，形成优秀的原创性论文。参赛作品经过公平、公证、公开的审评，将于2013年6月中下旬公布获奖结果。经评选出的优秀论文，将荣获鹰图论文大赛名次和丰厚奖金，以及鹰图大中华区用户大会入场券，其作品亦有机会在《中国勘察设计》杂志上发表。请于 2013 年 5 月 15 日提交您的参赛作品。点击浏览更多信息。欢迎大家踊跃报名！您可以将参赛作品寄至鹰图北京办公室：地址：北京市朝阳区建国路91号金地中心写字楼A座11层1101-1107室，100022 联系人：李洋王敬怡联系电话： +86 10 5760 1537/1526 该贴已经同步到 Horse的微博查看更多 1个回答 . 3人已关注

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简介

职业：浙江安联检测技术服务有限公司 - 给排水工程师

学校：河南工业职业技术学院 - 化学工业职业学院

地区：重庆市

个人简介：不是所有的付出都能换来对方的领悟，不爱你的人怎么会意识到你最美的青春都在陪他吃苦。查看更多

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