如何用生物法合成6-羟基烟酸？

本文将讲述如何用生物法合成6-羟基烟酸，旨在为相关领域的研究人员提供参考依据和实验支持。

背景：6-羟基烟酸是一种很重要的化学中间体,在农药、医药、染料、材料等领域都有重要应用,因此6-羟基烟酸具有广阔的应用前景和市场需求。目前,生产6-羟基烟酸主要是通过化学合成法生产,利用生物法生产正在尝试之中。相对于化学法合成,生物法生产具有转化效率高、专一性强、条件温和、环境友好、流程简单、提纯容易等特点,由于这些特点,目前利用微生物法转化烟酸生产6-羟基烟酸的研究已经成为了一个国外研究的热点。

人们研究发现了许多种微生物都有将烟酸转化为6-羟基烟酸的能力,例如:Nagasawa报道了荧光假单孢(Ps eudomonas fluorescens)TN5菌株,Hurh报道了粘质沙雷菌(Serratia marcscens)IFO12648, 目前国内开展的生物法生产6-羟基烟酸相关研究报道还比较少,主要采用较落后化学法生产6-羟基烟酸,成本较高,国内的市场基本也被外国公司垄断,价格偏高,严重限制了国内相关产品的开发和应用。

恶臭假单胞菌NA-1菌体培养转化和静息细胞转化联合工艺生产：

（1）生物量的测定

在分光光度计600nm处(110cm光径)测定稀释10倍的菌体培养液的OD600值,以同样稀释度的培养基为对照。

（2）菌体细胞诱导培养和培养转化

菌体细胞诱导培养:恶臭假单胞菌NA-1培养于含有150mL培养液的500mL三角瓶中,30℃、200r/min, 振荡培养48h。菌体细胞培养转化:在上述培养过程中,在8～24h的过程中每隔2h周期性地补充一定量用0.02mol/L磷酸缓冲液配制的20%(W/V)烟酸(pH7.0)溶液,以维持培养液1% (W/V)烟酸浓度, 48h后停止。培养液配方为:每升含酵母膏 10g,蛋白胨 10g,K2HPO4·3H2O 3.93g,KH2PO4 1g, 烟酸 10g, pH 7.0。分析培养液中的烟酸羟基化作用:培养过程中,在指定时间取适量的发酵液,100℃灭活5min,然后离心去除细胞,供HPLC分析。

（3）静息细胞降解6-羟基烟酸

恶臭假单胞菌NA-1培养于装有150mL培养液的500mL三角瓶中,30℃、200r/min摇床培养。离心收集菌体,获取的静息细胞用0.02mo l/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤两次,重新悬浮于等体积的以0.02mol/L磷酸缓冲液配制的不同浓度6-羟基烟酸的转化液中,30℃、200r/min摇床转化48h。每隔4h取液,100℃灭活5min,离心,取上清HPLC测试。

（4）测试静息细胞的羟基化活力

取发酵过程中的菌液2mL,离心所得菌体用0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤两次,重新悬浮于等体积的以0.02mol/L磷酸缓冲液配制的1%(W/V)转化液[6],30℃、200r/min在50mL离心管中转化2h,100℃灭活5min,离心(5000r/min,10min),取上清HPLC检测。

（5）菌体培养转化和静息细胞转化联合工艺生产6-羟基烟酸

恶臭假单胞菌NA-1的细胞培养转化过程见1.3。48h后发酵转化过程停止,5000r/min离心10min,上清液用浓盐酸调节pH至2,析出的6-羟基烟酸用浓盐酸调节的pH为2的双蒸水洗涤后重结晶、干燥。

静息细胞转化是将发酵过程收集的菌体用0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤两次,重新悬浮于等体积的以0.02mol/L磷酸缓冲液配制的1% (W/V)烟酸转化液,30℃、200r/min转化,在2～24h过程中每隔2h周期性地补充以0.02mol/L磷酸缓冲液配制的20%(W/V)烟酸溶液以维持转化过程所需要的1% (W/V)烟酸浓度,48h后离心,上清同前处理获得晶体。

参考文献：

[1]袁梅. 极小单胞菌Pusillimonas sp.T2分解代谢烟酸的关键基因功能研究[D]. 浙江工业大学, 2018.

[2]尹祖建,罗晖,常雁红等. 一株高效催化烟酸羟化反应菌株的筛选及鉴定 [J]. 工业微生物, 2008, (05): 50-54.

[3]杨瑶. 吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的基因克隆与表达的研究[D]. 南京师范大学, 2008.

[4]徐莉,袁生,陈婷等. 恶臭假单胞菌NA-1菌体培养转化和静息细胞转化联合工艺生产6-羟基烟酸研究 [J]. 微生物学报, 2006, (01): 63-67. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2006.01.014

[5]徐莉. 生长细胞转化和静息细胞转化同时用作羟基化烟酸的研究[D]. 南京师范大学, 2005.