超声破碎中遇到的困难和如何提取胞质蛋白?

重悬后为黑色，主要应该是楼上所说的菌体的炭化，在超声波破碎时我都是在冰浴中进行的，可以使破碎时产生的热量尽快扩散。

需要包浆中的蛋白可以在细胞破碎后离心收集上清，然后柱层析即可。收集包含体也可在破菌后离心收沉淀。关于黑色东东 应该就是各位说的碳化结果，据我所知，超声破菌时一定要控制好温度。

1.对大肠杆菌而言超声功率在500左右就足够了，再大的话就对你的蛋白有影响了；2.我感觉你第二步的反复冻融是有点多余，可以不要，直接破碎；如果你感觉你的菌体很难破碎，或者超声破碎的效率很低的话，先用溶菌酶处理半小时，然后再超声；3.Triton X-100直接加到Lysis Buffer里，在超声时也可以保护你的蛋白；4.你大功率超声30s，这样的时间太长了，容易造成局部温度过高，产生碳化现象；5.可以加大尿素的浓度，用个4M没什么问题，也许会让你的包涵体纯点吧。

加了融菌酶之后菌体是会变得很粘，那属于正常现象，因为核酸的释放问题。你说的超声效果没提高很多，是什么意思，你原来的效果有多高呢，如果原来的就有95％以上了，那你还期望有很明显的提高吗。另，你的上清目的蛋白少了，你有没有作平行对照呢。会不会是这批菌体本身表达就低了呢。超声时间少了菌体没超完，那么就稍微延长一点时间拉，另有个小建议，你用BUFFER重悬菌体时，尽量用VORTEX把菌体重悬的均匀一点，这样破菌的效率会高一点。

我觉得超声前的冻融意义不大，还可能导致一些本来水溶性的蛋白聚集或变性，所以后面wash完，会有更多的杂蛋白留在pellet里。可以考虑加点溶菌酶，作用一段时间在去超声。发酵完离心获得菌体pellet和sup，sup中很有可能是有活性的蛋白，可以直接纯化。这样可以避开包涵体复性的复杂过程。超声破碎的时候，一定要注意控温！同时，pellet进行超声破碎，及纯化前的wash 和变性提取。wash的目的主要是在纯化前降低杂蛋白的量，一定程度上减少纯化的负担。超声的buffer中不一定要有还原剂，要根据你的蛋白来定，不过wash buffer和extract buffer一般是要加还原剂的。wash buffer中的urea浓度可以为1~4M，Triton X-100一般在0.5~5%，要根据你的蛋白来具体情况具体对待，一般的包涵体是不会提取出来的，可以做个预实验，跑个SDS-PAGE就可以看出来的。这样可以得到比较纯的蛋白，然后再进行纯化和复性。wash的条件摸好后，可以多处理一些，将待提取的pellet放在-80保存，可以保存很久，然后以此为起点，进行下面的纯化。

1.可能是超声破碎间隔的时间不够长，导致菌体的炭化，从而使得最后得到的沉淀重悬后是黑色的。超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。建议你适当延长破碎间隔的时间，暂停1min试试。2.你“大功率超声15次”，以及后来“加入1%Tritongx-100超声3次，该步骤重复两次”，根据我提包涵体的经验，我觉得次数太多了，最多10次就够了。次数过多会破坏你的包涵体蛋白。我用的是大肠杆菌KG表达载体表达的包涵体，超声破碎10次都看起来不清亮，不过后来跑PAGE胶还是有大量表达蛋白。3.看超声裂解细菌是否完全，最简单的方法，就是：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察。切记：只用结晶紫染色。

1 最后的沉淀为黑色, 有可能超声炭化, 但也可能其它的原因,比如杂质, 化学试剂的影响等等；2 你的超声次数可能是多了点, 其实判断超声, 只要看一下菌液有没有从浑浊变澄清,如果已澄清,那大致就差不多了.3 至于"跑电泳的结果就像是全菌液一样", 这是因为超声洗涤只能去除可溶性的蛋白(包括胞浆蛋白和一些膜蛋白), 一些不溶性的成分还在,所以看上去就变化不大了.4 如果上清液中也有表达,那就好办了, 因为pET28a载体是带有His标签的,只要阅读框正确, His Tag得到表达的话, 你可以用Ni 柱进亲和纯化了(安玛西亚等好多公司有买, 方法试剂盒上有).