一、DMSO在细胞培养中的浓度不能>0.1%，这点并不是绝对的。应该大致做个DMSO的浓度曲线，看其对该种细胞特定检测指标的影响，看看1%是否会对你所要检测的指标造成显著的影响。如果有显著影响，就将1%DMSO组作为溶剂对照来消除这种影响。还应注意在加药作用细胞时先用培养基稀释好试剂在加入细胞，以避免DMSO局部过浓对细胞造成的损伤。二、如果原装管小于5ml，肯定要换到其他容器溶解。

为啥没有内参或本底呢？

做个浓度梯度，比如20-50uM.浓度是10mg/ml，20uM就是2ml体系里面加4ul。

PI3K抑制剂化合物GDC-0032，即名为2-(4-(2-(1-异丙基-3- 甲基- 1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂-9- 基)-1H-吡唑- 1-基)-2-甲基丙酰胺，也称为塔西利昔(taselisib)、RG7604。

GDC 0032

如何进行分离纯化？

将 1.15kg、2.50摩尔粗的2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基 -1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并 [f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺于MeOH(6L,5vol)中的浆液加入至 50L玻璃反应器中。将额外MeOH(24L,21vol)添加于混合 物中，然后将其加热至65℃。获得均匀混合物。经添加埠将Si-thiol(Silicycle,Inc., 0.23kg,20％wt) 添加至溶液中且将混合物搅拌3小时。然后经Aurora过滤器(夹套温度＝ 60℃) 将其热过滤，精致过滤并直接转移至具有减压的第二50L反应器中。然后将溶液加热回到65℃内部温度(IT)。使均匀溶液冷却至54℃并在向反应器施加减压的情况下添加晶种(12g,1％wt)/MeOH(50mL)。然后使混合物经16小时冷却至20℃。然后经Aurora过 滤器过滤固体并在80℃干燥72小时，得到921g、80％产率的呈甲醇化物溶剂化物(根据XRPD 为形式A)的 GDC-0032并将其转移至预称重的Charge-point袋中。在分离器中将固体在IPAc(8L,7vol)中浆化并转移至干净10L反应器中。将混合物 在60℃(IT)搅拌1h。然后将固体经Aurora系统过滤并在80℃(夹套) 干燥96h。取出GDC- 0032样品并通过GC分析(IPAc＝1％)。为尝试更有效的干燥，将API转移至分离器中的两个玻璃托盘并用干燥袋密封，之后在设定为100℃的真空烘箱中干燥16h。GC(IPC：Q12690V2) 显示仍存在1％溶剂。该方法提供760g(68％校正产率，68％wt，99.9％纯度(经LC))白色固体(根据 XRPD为形式B)。将粗的GDC-0032(340.7g)加入至2L HDPE瓶中并用0.8L异戊醇(IAA) 浆化。将浆液转移至20L反应器中并用6.7L圆底烧瓶(总计22vol)稀释。加热白色浆液直至观察到溶液 (内部温度上升至118℃，然后冷却至109℃)。将溶液精致过滤(0.2μM过滤器)。烧瓶配备有顶置搅拌器并将滤液在异戊醇 (344mL,21vol)中浆化。使混合物温热至95℃(内部)直至固体溶解。加入炭 (10wt％,0.16g)及Silicycle thiol(10wt％,0.16g)于异戊醇(1vol, 16mL)中的浆液并将混合物在90-95℃搅拌1h，然后过滤(经垫)。使透明琥珀色溶液冷却至73℃(种晶温度范围＝70±5℃)并添加GDC-0032晶种(10wt％,0.16g)。关闭加热套的温度并使混合物在搅拌(200rpm)下冷却至室温过夜。在17hr 后，过滤白色固体，以缓慢重力过滤开始，然后施加真空。将固体抽吸干燥并混合20min直至获得自由流动的粉末。在烘箱干燥前的粗重量＝16g。将固体在100℃烘箱干燥24h，然后采样用于测试。继续在100℃ 再干燥24hr[1]。

参考文献

[1]J·斯塔尔茨 . GDC-0032的多晶型物、其制备方法和药物用途[P]. 瑞士：CN105829323B,2019-04-12.

加入PBS后，溶液变浑浊，可以加入适量的HCl，就可以完全溶解了    

rapamycin有很多类似物、衍生物，例如， Everolimus Deferolimus Temsirolimus 它们之中或许都是这一通路的抑制剂，你查证吧。

引言：

LY294002是一种广泛研究的特定抑制剂，主要用于抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）活性。由于其在细胞信号传导和癌症研究中的重要性，LY294002被广泛应用于探索PI3K途径在肿瘤发生、发展及其他疾病中的作用。

简介：

2-吗啉代-8-苯基色酮，即LY294002/PI3K抑制剂。英文名称：LY 294002 HYDROCHLORIDE，CAS：154447-36-6，分子式：C19H17NO3。

LY294002 是一种蛋白激酶抑制剂，可以阻断磷脂酰基-3-激酶的细胞信号通路 并抑制PI3Kα、PI3Kδ和PI3Kβ的表达。LY294002可以进入细胞并抑制PI3K和PI3K/Akt信号通路，包括抑制Akt磷酸化，从而抑制细胞分裂并诱导胰腺癌的G1停滞和其他单元格。

1. 应用

（1）LY294002 是一种含吗啉的化合物，是多种蛋白质的强效抑制剂，也是磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K) 的强效抑制剂。它通常被认为是一种非选择性研究工具，不应用于旨在唯一靶向 PI3K 的实验。

（2）其中两个是原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 (PIM1) 和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶 P110 γ|催化亚基 γ 异构体。它的 IC50 为 1.4 μM，效力略低于另一种众所周知的 PI3 激酶抑制剂Wortmannin。然而，LY294002 是 PI3K 的可逆抑制剂，而Wortmannin的作用是不可逆的。

（3）使用 LY294002 可通过一种不依赖末端钙离子的机制，显著加速蛙神经肌肉接头处的 MEPP 频率 (150 μM)。LY294002 通过扰乱突触结合蛋白功能，导致 MEPP 释放。

（4）LY294002 还是一种 BET 抑制剂（例如 BRD2、BRD3 和 BRD4 抑制剂）。

（5）研究表明，LY294002 给药对槲皮素抗丙型肝炎病毒的抗病毒活性具有附加作用。

2. 作用机制

LY294002和wortmannin是结构上不同的PI3K抑制剂，通过不同的机制抑制这种激酶的活性。LY294002是一种源自天然生物黄酮槲皮素的化合物，通过竞争性抑制p85α亚基上的ATP结合位点来抑制PI3K活性。过去十多年里，LY294002已经在神经、心血管、免疫和与糖尿病相关的细胞功能研究中得到应用。PI3K抑制剂wortmannin是一种源自真菌代谢物的分子，通过不可逆的共价结合作用于PI3K的p110亚基。LY294002和wortmannin通常一起使用来研究PI3K通路的信号传导。

3. 缺点

Wortmannin 和 LY294002 被认为是第一代 PI3K 抑制剂，但它们是非异构体特异性 PI3K 抑制剂。Wortmannin 是一种不可逆的非竞争性 PI3K 抑制剂，由于它与结合位点的赖氨酸残基形成共价键，IC50 值在低纳摩尔范围内。不幸的是，这种缺乏选择性的不可逆抑制（抑制 PI3K、m-TOR 和其他不相关的蛋白质）导致高毒性，因此临床上已停止使用 。LY294002 是一种真菌代谢物，通过竞争性抑制 PI3K 的 ATP 结合位点来抑制所有 PI3K 类。异构体 p110α 的 IC50 值为 0.55μM，异构体 p110β 的 IC50 值为 16μM，异构体 p110γ 的 IC50 值为 12μM，异构体 p110δ 的 IC50 值为 1.6μM。它还抑制 PI3K II、III 类和 m-TOR（IC50 值为 2.5μM）。然而，溶解性差、生物利用度差和代谢降解速度快阻碍了进一步的生物学评价，促使人们寻找更方便的抑制剂。

参考：

[1]https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/ly294002

[2]https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0223523419308700

[3]https://en.wikipedia.org/wiki/LY294002

[4]El‐Kholy W, Macdonald P E, Lin J H, et al. The phosphatidylinositol 3‐kinase inhibitor LY294002 potently blocks Kv currents via a direct mechanism[J]. The FASEB Journal, 2003, 17(6): 720-722.

在临床二期阶段，Pilaralisib被广泛应用于乳腺癌、淋巴瘤和实体肿瘤的治疗。目前尚未公布最新的研究进展。这种化合物最初由Exelixis公司开发，后来于2009年将治疗实体肿瘤方面的权利授权给赛诺菲公司。XL147 (SAR245408；Pilaralisib)是一种口服生物相容性的PI3K抑制剂，对PI3Kα，β，δ和γ的IC50分别为39nM，383nM，36nM和23nM。

Omipalisib是一种正在进行临床一期研究的药物，主要用于治疗特发性肺纤维化、实体瘤和淋巴瘤。而GSK2126458则是一种高度选择性和有效的PI3K抑制剂，它可以抑制p110α/β/δ/γ和mTORC1/2的活性。其Ki值分别为0.019nM / 0.13nM / 0.024nM / 0.06nM和0.18nM / 0.3nM。

Apitolisib是一种由基因泰克研发的药物，目前正处于临床二期阶段，用于治疗乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和肾肿瘤。虽然目前尚未公布最新的研究进展，但该化合物在治疗非霍奇金淋巴瘤方面的临床一期研究已经展开。

Apitolisib是一种I型PI3K抑制剂，对PI3Kα/β/δ/γ具有作用，其在无细胞试验中的IC50分别为5nM / 27nM / 7nM / 14nM。此外，它还是一种mTOR抑制剂，其在无细胞试验中的Ki为17nM，相较于其他PIKK家族激酶，具有更高的选择性。