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刘

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PCR反应实验操作注意事项有哪些实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： (1) 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。 (2) 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。 (3) 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。 (4) 操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP 、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。 (5) 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。 (6) 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证 PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。 (7) 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少 PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。 (8) 重复实验，验证结果，慎下结论。查看更多

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PCR反应循环过程陈述 PCR反应循环过程陈述： 1.初始化步骤。这仅对热启动 PCR 必不可少。此步骤将溶液加热至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。 2.变性步骤。DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。 3.退火步骤。变性后，反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 DNA 组装。 4.伸长步骤。在此步骤中，DNA 聚合酶开始合成 DNA，因此温度应为 DNA 聚合酶的最适温度。一般选择 72°C，但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说，DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。 5. 2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个 PCR 过程使用 30-35 个循环。在 PCR 循环的早期，PCR 产物以指数速率积累，而在 PCR 循环的后期，随着 dNTPs、引物的减少和 DNA 聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR 速率逐渐下降。 6.最终伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。 7.贮存。最终产品可以在 PCR 机器中维持温度在 4-10°C。查看更多

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单克隆抗体的优点与缺点是什么单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）是一种由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和均一性。单克隆抗体的优点与缺点： 1.单克隆抗体的优点： (1)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。 (2)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 (3)由于可能得到“无xian量"的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。 (4)杂交瘤可以在体外“永jiu"地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地高特异性、高均一性的抗体。 2.单克隆抗体的缺点： (1)单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。 (3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也昂贵。查看更多

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菌种传代保存法优缺点有什么有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行ATCC菌种转接、培养后再保存，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用菌种的保存。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于适生长温度为好。若为产酸ATCC菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的ATCC菌种则可以室温直接保存。传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如： ① ATCC菌种管棉塞经常容易发霉； ② 菌株的遗传性状容易发生变异； ③ 反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低； ④ 需要定期转种，工作量大； ⑤ 杂菌的污染机会较多。查看更多

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ELISA检测试剂盒评价标准是什么 ELISA检测试剂盒评价标准： 1、准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，应大于等于0.9900。 2、灵敏度：反应试剂盒的最低检测浓度。 3、特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 4、重复性：板内、板间变异系数。 5、回收率：判断实验的准确性和特异性。查看更多

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ELISA实验工作浓度的选择方法在建立一种ELISA方法时，对于抗原抗体最适工作浓度的选择是非常重要的，不仅可以快速摸索出ELISA的最优条件，还可以节约测定时间和成本。下面以夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。 a. 用包被缓冲液稀释单克隆抗体，浓度分别为10ug/ml、5.0ug/ml、2.5ug/ml、1.0ug/ml, 包被酶标板，每一浓度包被1横行，每孔100ul。4 ℃过夜包被，洗涤3次； b. 5%脱脂奶粉封闭酶标板， 37℃孵育1h，洗涤3次； c. 在每条包被孔中加入空白对照和标准品，每个空白对照和标准品为一组，依次加入，各100ul，37℃孵育1h，洗涤3次； d. 在每一包被浓度的一条中分别加入按1:2000、1：4000、1：8000、1:16000 稀释的兔多抗， 37℃孵育1h，洗涤3次； e. 在每一包被浓度的一条中分别加入HRP标记羊抗兔igG，稀释度先按说明书上的推荐稀释比进行稀释，37℃孵育30min，洗涤5次； f. 加TMB底物，37℃避光显色10-15min，用2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450nm读取吸光度（OD）值； g. 测得的标准品OD值在2.0左右，阴性对照OD值小于0.1的组合为较理想的组合。可根据初步确定的浓度缩小间距,再做进一步棋盘滴定,寻找最佳包被条件。注意：抗体做稀释时最好用同一个原始浓度做倍比稀释，这样可以尽量减少由于加样枪造成的误差及人为误差。查看更多

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逆转录 PCR（RT-PCR）实验要素有什么？ RT-PCR 就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录 PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板： 1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配对，可合成全长的 cDNA，但仅扩增有 polyA 尾的 mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续 qPCR 实验。基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。 2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的 RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适 pH8.3，在高反应温度时可消除 mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH 活性，最适温度37℃，最适 pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。 3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整度，完整的总 RNA 在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的28S 和18S rRNA 条带（真核样品），28S rRNA 条带的强度应当大致为18S rRNA 条带的两倍，并且无 gDNA 和蛋白残留。查看更多

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标准物质制备一般步骤是什么？标准物质的制备是一个关键的过程，确保其质量和可追溯性。下面是标准物质的制备一般步骤： 1、确定目标物质和纯度要求：确定所需的目标物质以及其纯度要求。这可能涉及从商业供应商购买纯品，从自然来源提取物质，或者通过化学合成等方式制备目标物质。 2、基于定量分析方法：建立适当的定量分析方法，以确保目标物质的含量可以准确地测量。这通常涉及使用已知浓度的标准物质进行校准和验证。 3、制备溶液或混合物：根据定量分析方法，准备目标物质的溶液或混合物。这可能包括将目标物质溶解于适当的溶剂中，并按照特定的配比混合。 4、纯化和分离：如果目标物质需要纯化或分离，可采用各种技术，如结晶、萃取、色谱等。这些步骤有助于提高目标物质的纯度并去除杂质。 5、分装和包装：将制备好的标准物质分装到适当的容器中。这些容器通常是气密密封的，以保持标准物质的稳定性和防止污染。 6、认证和验证：对制备好的标准物质进行认证和验证，以确保其符合预定的纯度和含量要求。这包括使用已知浓度的标准物质进行比对，进行精确的定量分析，以确保制备的标准物质的准确性和可追溯性。 7、标签和文档：为制备好的标准物质添加正确的标签和文档，包括目标物质的名称、纯度、溶液浓度、有效期限、储存条件和安全注意事项等信息。 8、储存和保管：将制备好的标准物质储存和保管在适当的条件下，以确保其稳定性和持久性。这可能包括在低温、干燥或光线受限的环境中储存，并采取适当的防护措施以避免污染或降解。 9、制备标准物质需要严格的实验操作和控制，确保其质量、可追溯性和稳定性。每个制备过程可能会因所需的目标物质和特定的分析要求而有所不同。因此，在制备过程中应根据具体情况和所需标准遵循相应的实验操作和质量控制规程。查看更多

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菌种的传代流程是什么菌种的传代: 1、标准菌株的复苏： ① 菌种操作应在无菌条件下进行，防止杂菌污染。 ② 每次使用和复苏时只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。 2、标准储备菌株每转接一次须进行确认。（确认方法一般为他们各自独有的形态，在鉴别培养基上的形态） 3）、工作菌株转接的方法： ①、配制营养琼脂培养基（溶血性弧菌加3%氯化钠），121℃高压灭菌15分钟后分装在试管内，冷却后备用。 ②、在无菌条件下，用接种环挑取菌苔至新鲜试管上作“米”字形划线接种，放置在36℃的培养箱内培养24小时。 4、工作菌株的使用 ①内部质量控制：一个月一次阳性对照、培养基每批验收； ②外部质量控制：能力验证、实验室比对； 5、工作菌株的期间核查 ① 期间核查的频率：每半年对使用标准菌株进行一次期间核查。 ② 工作菌株期间核查的方法及依据：同工作菌株的确认一样。 ③ 建立标准菌株期间核查记录。查看更多

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如何确定是否存在引物二聚体？凝胶电泳是显示引物二聚体的一种极佳的方法。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位100 bp 以下。在 PCR 过程中，二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。引物二聚体通常随模板的减少而增加。单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于，其灵敏度最低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。凝胶电泳分析的优势是当解离曲线 (熔解曲线) 数据同时可用时，产物的大小有助于对结果进行综合解释。解离曲线，又称熔解曲线，是利用双链 DNA 结合染料获得的标准反应热廊线。如果扩增具有极好的特异性，则实时荧光定量 PCR 板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽的“波形”，显示其在 70°C 左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。若对解离曲线中是否存在引物二聚体有任何疑问，可将观察的结果与 NTC（No Template Control，即无模板对照，是阴性对照）反应孔相比较，当模板不存在时，更易出现引物二聚体峰。可利用 NTC 样本在熔解曲线中产生多余的峰识别出引物二聚体。查看更多

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什么是ELISA测试？ ELISA检测是一种免疫检测方法，通常用于测量生物样品中的抗体或抗原，包括蛋白质或糖蛋白。像其他免疫检测法一样，它们依靠抗体与目标的结合来促进检测。通常情况下，ELISA检测是在96孔板中进行的，这种形式使其适合于一次筛选许多样品。血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液都是用于这些检测的常见样品类型，但理论上大多数液体样品类型都可以使用。然而，重要的是要考虑到一些样品类型可能包括抑制性因素，如共享相似抗原表位的缓冲液成分[1]或可能损害目标或检测成分的蛋白酶[2]等因素，这些因素可能干扰检测的性能。有几种不同的检测形式，但都依赖于目标本身或能够捕获目标的抗体/抗原与包被板表面的结合。然后采用测定步骤，包括结合抗原，或更常见的抗体，以使成功的结合被测定和量化，最常见的是通过比色测定。查看更多

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辨别elisa试剂盒检测目的抗原方法是什么？利用干扰实验即可辨别 elisa试剂盒是否检测目的抗原，方法如下： 1、将针对试剂盒特异性的重组蛋白抗原和试剂盒中的检测抗体配置成 antibody: antigen≈1:2的混合孵育液； 2、 37℃孵育15分钟后，代替原试剂盒中的检测抗体； 3、后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物 4、实验完毕后，检测其标准曲线，如果标准曲线良好则说明加入的目的抗原和试剂盒抗体不匹配，试剂盒检测抗体针对的是非目的抗原，该试剂盒为伪劣假造 elisa试剂盒。 5、如果标准曲线无线性，则说明试剂盒检测抗体已被目的抗原中和或干扰，影响了其实际试剂盒抗体的检测作用，则该试剂盒检测抗体针对的是目的抗原。查看更多

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简介

职业：上海抚生实业有限公司 - 客服

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个人简介：上海抚生实业有限公司 Shanghai Fusheng Industrial Co., Ltd.成立于2012年，经过数年的努力已迅速成为集科研和生产为一体的专业化生物工程公司。特别是ELISA研发，代测，技术服务这一产品已使上海抚生成为中国知名公司。公司产品涵盖ELISA研发、细胞培养，各种生化试剂、各种酶类、分子生物学试剂盒、培养基、自产实验室耗材、小型仪器等。此外、上海抚生还代理了美国药典标准品，中检所标准品，sigma，ScienCell，ATCC，wak0，omega，Worthington、MBI、Bioworld、Calendon等国外各类知名公司的产品。上海抚生将进一步加强人才经营、产品经营，不断提升企业的核心竟争力，实现具有高科技产业体系、知识化创业团队的国际化的公司，服务于生命科学领域，迎接世界经济一体化所带来的机遇与挑战。查看更多

企业简介

企业名称：上海抚生实业有限公司

企业性质：代理商,

主营业务：生化试剂，标准品,对照品，PCR试剂盒，核酸检测试剂盒，荧光定量检测试剂盒，生化试剂盒，比色法试...

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