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酪胺染料实验过程中会出现哪些问题呢酪胺染料的标记，可能会遇到的问题： 1.非特异性染色：酪胺染料在被HRP催化后，氧化的酪胺具有高度反应性，可能与样本中多个位置的蛋白质发生共价结合，导致背景信号增加。建议：优化过氧化氢和酪胺的浓度，能减少非特异性染色。降低酶反应时间也有助于减少背景信号。这些都需要客户根据自己的实验进行调整，我们无法给他们一个确定的浓度去尝试。因为不同的实验，环境，操作，都会出现不同的结果。 2.过度放大导致的信号溢出：TSA是一种高灵敏度方法，但如果信号放大过度，可能会导致荧光信号过于强烈，从而掩盖真正的信号，甚至导致伪阳性结果。建议：控制 HRP和酪胺染料的反应时间，避免放大效应过强，防止产生虚假信号。可以通过进行时间优化实验来确定反应时间。 3.反应条件过强导致抗体损伤：TSA反应中使用过氧化氢，这是一种强氧化剂，如果浓度过高或反应时间过长，可能会损伤抗体或样本中的其他蛋白质，从而影响标记效果。建议：使用较低浓度的过氧化氢和较短的反应时间以减少对抗体和其他样本的潜在损伤，同时保持信号强度。 4.标记不均匀或效率低：标记过程中可能出现标记效率低或标记不均匀的情况，这会导致信号强度不足或者某些区域信号较弱。建议：确保抗体和染料之间充分接触，且反应环境适宜。优化 HRP的量、底物浓度以及反应时间有助于提高标记的均匀性和效率。 5.光漂白：酪胺染料在荧光显微镜下可能会受到光漂白，导致信号逐渐减弱。建议：减少样本暴露在强光下的时间，使用抗光漂白的封片剂，能够延长荧光信号的持续时间。 6.样本自发荧光干扰：样本本身可能具有自发荧光，特别是当使用荧光标记的酪胺染料时，这可能会影响实验的信号检测。建议：选择具有不同光谱的荧光标记物，并使用适当的滤光片来减少自发荧光的干扰。此外，可以对样本进行预处理以减少自发荧光。 7.多重标记实验中的交叉反应：在多重标记实验中，使用不同的酶和酪胺染料时，可能会发生交叉反应，导致信号混杂。建议：使用不同的酶标抗体和酪胺染料来避免交叉反应。此外，确保每一步的反应物都被彻底洗掉。查看更多

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百萤问号之活性氧 MiteROS 线粒体ROS 580实验方案是怎样的百萤活性氧 MiteROS 线粒体ROS 580概述 MitoROS 线粒体活性氧荧光探针580是用于检测线粒体活性氧的荧光探针，活性氧（ROS）是含氧的化学反应性分子。实例包括超氧化物，羟基，单线态氧和过氧化物。由于存在不成对的价电子，ROS具有高反应性。ROS形成氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而，在环境压力（例如，UV或热暴露）期间，ROS水平可显着增加。这可能导致细胞结构的显着损害。累积地，这被称为氧化应激。MitoROS 580是一种超氧化物敏感染料，在加载到活细胞后定位于线粒体。超氧化物氧化MitoROS 580会产生红色荧光。MitoROS 580可用荧光显微镜或荧光流式细胞仪监测线粒体中的超氧化物。MitoROS 580试剂渗透活细胞，选择性地靶向线粒体。它被超氧化物迅速氧化。它不太可能被其他活性氧（ROS）和活性氮物质（RNS）氧化。氧化产物在细胞中高度荧光。MitoROS 580为研究各种病理中的氧化应激提供了有价值的工具。百萤活性氧 MiteROS 线粒体ROS 580实验方案体ROS 580实验方案使用MitoROS580分析方案该协议仅提供指南，应根据您的具体需求进行修改。在制作MitoROS 580工作溶液之前，根据需要处理细胞。溶液配制 1）MitoROS 580 原液 (1000X)配制将 13 μL DMSO 添加到 MitoROS 580 小瓶中并充分混合。注意：未使用的原液可以储存在 -20 oC，避光保存。 2）MitoROS 580 工作溶液（2X）配制用 20 mM Hepes 缓冲液 (HHBS) 将 DMSO 原液稀释到 Hanks 溶液中，制成 2X 工作溶液。注意：2X MitoROS 580 工作液不稳定，请及时使用。操作步骤 1.细胞培养 2.将细胞（例如 96 孔板中的 100 μL/孔）与等体积的 2X MitoROS 580 工作溶液在 37°C 下孵育 10-30 分钟，避光。注意：MitoROS 580 的终细胞浓度不应超过 1 X。浓度超过 1 X 会产生细胞毒性效应，包括线粒体形态改变和荧光重新分布到细胞核和细胞质中。注意：不同细胞对 MitoROS 580 的反应不同，请相应调整工作浓度。 3.轻轻清洗细胞 3 次，并用 HHBS 缓冲液替换。 4.使用适当的荧光仪器 (例如, 荧光显微镜、流式细胞仪) 观察细胞。（Ex/Em = 510/580 nm）图1.MitoRO 580(10μM)对不同活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的荧光响应。在Ex/Em = 540/590 nm处监测荧光强度图2.使用 MitoROS 580 检测 Jurkat 细胞内的超氧化物。对于 AMA 处理（红色），将细胞在 37°C 下用 50 μM 抗霉素 A (AMA) 处理 30 分钟，然后与 MitoROS 580 一起孵育 1 小时。对于对照（蓝色），将细胞在 37°C 下与 MitoROS 580 一起孵育 1 小时，无需事先进行 AMA 处理。使用 BD FACSCalibur 流式细胞仪的 FL2 通道监测荧光信号。图3.使用 MitoROS 580 对 HeLa 细胞中的超氧化物进行荧光成像测量。HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种在 100 μL 中，并在具有黑色壁和透明底部的 96 孔板中孵育过夜。对于 AMA 处理组，在 37°C 下用 50 μM 抗霉素 A (AMA) 处理细胞 30 分钟，然后用 MitoROS 580 孵育 1 小时。在未处理的对照组中，在 37°C 下用 MitoROS 580 孵育细胞 1 小时，无需任何先前的 AMA 处理。使用带有 TRITC 滤光片的荧光显微镜测量荧光信号。图4.使用 MitoROS 580 检测 HeLa 细胞中的细胞内超氧化物。HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种在 100 μL 培养基中，并在具有黑色壁和透明底部的 96 孔板中孵育过夜。第二天，用 50 μM 绿脓菌素 (Pyo)、50 μM 抗霉素 A (AMA) 处理细胞，或不处理作为对照。这些处理在 37°C 下进行 30 分钟。随后，将细胞在 37°C 下与 MitoROS 580 一起孵育 1 小时。使用 CLARIOstar 微孔板读数仪 (BMG Labtech) 测量荧光信号，激发/发射波长为 540/590 nm，截止波长为 570 nm，使用底部读取模式。查看更多

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百萤课堂---关于Annexin V的那些疑惑 1. 百萤 ---Annexin V 简介 Annexin V 作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。 2. 百萤 ---Annexin V 适用仪器 Annexin V 凋亡检测试剂盒适用仪器：流式细胞仪、荧光显微镜 3. 百萤 ---Annexin V 常见问题以及解答 Q: 什么是 Annexin V/PI 测定？ A: Annexin V/PI 测定用于通过 annexin V 标记区分早期凋亡细胞和通过丙碘胺（ PI ）标记区分坏死 / 死亡细胞。在早期凋亡阶段，细胞膜开始失去不对称性，导致磷脂酰丝氨酸（ PS ）转位到膜的外表面，在此处 annexin V 共轭物可以检测到它。然而，在细胞膜破裂的情况下，例如坏死， annexin V 共轭物可以进入并结合内层膜中的 PS 残基，导致假阳性结果。因此，建议使用不透过细胞膜的核染料（如 PI ）与 annexin V 共轭物一起使用。这使用户可以区分早期凋亡细胞（ annexin V 染色）、晚期凋亡细胞（ annexin V 和 PI 染色）和坏死细胞（仅 PI 染色）。 Q: Annexin V 是什么颜色的？ A: 就其本身而言， Annexin V 是无色的且难以检测。为了检测 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸的结合， Annexin V 通常与异硫氰酸荧光素 (FITC) 结合， FITC 是一种绿色荧光化合物，激发峰为 491 nm ，发射峰为 516 nm 。用 FITC 或任何其他绿色荧光染料标记 Annexin V ，例如 iFluor 488 （ Ex/Em = 491/516 nm ）。 Q: Annexin V 和 TUNEL 有什么区别？ A: 末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 是一种染色方法，用于识别细胞内 DNA 片段化位点——晚期细胞凋亡的标志性特征。它使用酶末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 将修饰的 dNTP （例如 dUTP ）连接到片段化 DNA 链的 3'- 羟基末端。 dNTPs 通常用荧光团修饰以促进量化和 / 或可视化。 Annexin V 染色通过结合由于细胞膜不对称性丧失而暴露在细胞外的 PS 残基来识别细胞凋亡的早期阶段。 Annexin V 通常用 FITC 等荧光团标记，以促进凋亡细胞的检测。 Q: Annexin V 阳性是什么意思？ A: Annexin V 阳性结果表明细胞处于凋亡的早期状态，该术语通常用于 Annexin V/PI 检测，通过根据细胞群的健康状况来区分细胞群。详情如下： 1.Annexin V 阴性 /PI 阴性：说明细胞很健康 2.Annexin V 阳性 /PI 阳性：说明该细胞处于坏死或凋亡晚期。 Q: 什么是 Annexin V 的阳性对照？ A: Annexin V 阳性对照是使用已知的细胞凋亡诱导方法诱导凋亡的细胞。当用 Annexin V 偶联物（例如膜联蛋白 V-FITC ）染色时，这些细胞会产生阳性信号。例如，细胞凋亡可通过在 55 ° C 下加热细胞 20 分钟或处理已知可诱导细胞凋亡的细胞试剂（如喜树碱或星形孢菌素）来诱导。 Q: 什么是 Annexin V 结合缓冲液？ A: 在实验样品中， Annexin V 结合缓冲液能够促进 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸 (PS) 结合。这些结合缓冲液需要含有足够高浓度的钙，使 Annexin V 与 PS 结合，但不能高到与其他磷脂结合。 Annexin V 结合缓冲液也可用于洗涤样品，使其不含过量的膜联蛋白和其他化学残留物质，以确保检测。染色前，应将细胞重悬于浓度为 1x10^6/ml 的 Annexin V 结合缓冲液中。 Q: Annexin V 是怎样工作的？ A: Annexin V 通过结合暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 残基来识别正在发生凋亡的细胞。在活的健康细胞中， PS 残基位于质膜的内层，在那里它们无法与膜联蛋白 V 结合。当细胞启动程序性细胞死亡（细胞凋亡）时，它们的质膜会失去不对称性。 PS 残基从膜的内部转移到外部小叶，在那里它们可以与膜联蛋白 V 结合。 Annexin V 通常与荧光团（如 FITC ）结合，以促进凋亡细胞的检测。 Q: Annexin V 染色后，能否进行细胞固定 A: 可以，细胞可以在 Annexin V 染色后进行固定操作。如果需要固定细胞，请满足以下三个条件： 1. 使用不含酒精的醛类固定。 2. 请使用含有 CaCl2 的缓冲液。 3. 避免使用洗涤剂或表面活性剂。注意事项：在 Annexin V 染色前，千万不要固定细胞，固定细胞会杀死细胞，而 Annexin V 染色只能在活细胞或组织上进行。 Q: Annexin V 能染色坏死细胞吗？ A: 是的， Annexin V 可以染色坏死细胞。坏死是指不正常的细胞死亡，可能由各种事件触发，包括组织缺血和缺氧或细胞区域的急性损伤。坏死细胞的一个关键特征是质膜破裂。这个事件使得 Annexin V 可以进入整个质膜，包括 PS 残基存在的内叶片，导致假阳性。因此，建议使用细胞不渗透染料（例如丙碘锭或 7-AAD ）与 Annexin V 结合物相结合，以消除假阳性并区分凋亡细胞和死亡细胞。图中使用 Annexin V 将凋亡细胞染成绿色，使用 7-AAD 将坏死细胞染成红色。 Q: 染色完不能及时上机，样本能固定吗？ A: 细胞染色完成后，禁止固定，应尽快检测，若无法立即检测，可将样本管放冰上，减少外界环境对检测结果的影响， Annexin V 结合不稳定，请务必在标记结束后半小时内检测。 Q: 如何统计凋亡细胞数？ A: Annexin V 凋亡实验在做凋亡统计时一般统计细胞早期凋亡率，也有文献统计总的凋亡比例（早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和）。 Q ：血液样本是否可以用于凋亡检测？ A ：如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有 PS ，能与 Annexin-V 结合，从而对实验结果产生干扰。 Q ：有没有更好的办法处理贴壁细胞，来做流式凋亡实验？ A ：检测贴壁细胞时，若消化时间不易控制，建议用 Accutase 细胞消化液，对细胞损伤小且不会改变细胞膜上 PS 的分布。 Q: 细胞凋亡早期，可以用 Annexin V-FITC/PI 双染色法区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞吗 ? A: 在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（ phosphotidylserine ， PS ）位于细胞膜的内侧，细胞发生凋亡时，细胞膜发生变化， PS 从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。 Annexin-V （膜联蛋白 -V ）是一种分子量为 35-36 KD 的 Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力结合。用荧光素（ FITC 、 Alexa Fluor488 等）标记的 Annexin-V 作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜即可鉴别凋亡细胞和活细胞。坏死的细胞 PS 同样也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面， Annexin-V 也能识别坏死细胞表面的 PS, 所以 Annexin-V 无法区分坏死细胞和凋亡细胞。另外碘化丙啶 (propidine iodide, PI) 是一种核酸染料，能够与细胞内 DNA 结合，而且它不能透过完整的细胞膜。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整， PI 染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与 DNA 结合，所以 PI 染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而 PI 染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的 DNA 结合，坏死细胞内的 PI 染料被 488nm 激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以 Annexin V 和 PI 同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。图为 Annexin-V/PI 双染色后流式检测结果分析以上就是百萤对 Annexin V 凋亡检测常见问题的整理，欢迎大家一起讨论。查看更多

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百萤-荧光谷胱甘肽分析试剂盒问答 1.Amplite 荧光谷胱甘肽GSH / GSSG比率测定法如何工作？该测定实际量化了什么？答： Amplite 荧光谷胱甘肽GSH / GSSG比率测定试剂盒*绿色荧光*（货号10056）包含仅与还原型谷胱甘肽（即 GSH）反应而不与GSSG反应的探针。通过测量还原前的GSH浓度和还原后的总GSH浓度，用户可以计算GSSG浓度以及GSH / GSSG比率。有关特定的方程式和过程，请查阅我们的示例协议。 2.我的Amplite 荧光谷胱甘肽GSH / GSSG比率分析试剂盒的GSH和总GSH校准曲线是否有问题？为什么我的标准曲线没有意义？答：从理论上讲，谷胱甘肽和总谷胱甘肽的校准曲线应相当接近。要记住的重要一点是，连续稀释后 [GSH]为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563、0.0781和0 μM，而[TGSH]为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125， 0.1563和0 μM。在相同的系列稀释后。这是因为GSSG / GSH摩尔比为：1 GSSG? 2 GSH。因此，绘制标准曲线时，TGSH的x轴值需要是GSH的x轴值的两倍。 3.我可以将Triton X-100用作 Amplite 荧光谷胱甘肽GSH / GSSG比分析试剂盒*绿色荧光*（货号10056）的裂解缓冲液吗？我可以使用 X缓冲液裂解/制备样品吗？答：您可以使用 Triton X-100，但是它可能会导致测定读数的背景增加。有关特定缓冲液的其他问题，请通过helen@aatbio.com与我们的技术支持联系。 4.在使用 Amplite 荧光谷胱甘肽GSH / GSSG比率分析试剂盒*绿色荧光*（货号10056）之前，我需要对样品进行脱蛋白处理吗？答 ;如果发现不一致或意外的结果，则一种解决方案可能是在使用测定之前对样品进行脱蛋白处理。 5.为什么我的GSH浓度大于总GSH浓度？为什么我计算出的GSH / TGSH比值大于1？答：这种结果有多种可能的原因。例如， [GSH]和[TGSH]之间可能没有统计学上的显着差异，表明样品中的GSSG很少甚至没有。在这种情况下，由于实验偏差，GSH浓度可能会大大高于GSH总浓度。另一种可能的解释是由于测定活性降低，可能导致测定结果不一致。该测定成分在室温下以及暴露于光线下均不稳定，应在制备后的两个小时内使用。对于具有更高稳定性的试剂盒，我们建议使用 Amplite 快速荧光谷胱甘肽GSH / GSSG比率检测试剂盒*绿色荧光* 。 6.为什么总GSH标准溶液浓度等于GSSG标准溶液浓度的两倍？为什么[GSSG]等于（[总GSH]-[GSH]）除以2？答：还原后， 1摩尔GSSG变为2摩尔GSH。因此，如果初始GSSG浓度为1μM，则还原后的GSH浓度为2μM。相反，要从[总GSH]中确定[GSSG]，则必须除以2以说明GSSG与GSH的摩尔比：1 GSSG? 2 GSH。 7. Amplite 荧光法谷胱甘肽GSH/GSSG比率快速检测试剂盒绿色荧光（Cat＃10060）中提供的探针仅与还原的 GSH反应，而与GSSG不反应。为什么还需要准备GSSG标准曲线？答：在氧化应激期间， GSSG会在细胞中积累，从而增加GSSG与GSH的比例。由于Thiolite Green 520WS仅与GSH反应，因此必须首先将累积的GSSG酶转化为GSH。因此，要测量GSH和总GSH，必须创建GSH和GSSG标准曲线。减少的GSH使用GSH标准测量，总GSH（GSH和GSSG）使用GSSG标准测量。要计算GSSG，请从总GSH中减去GSH量，然后使用此值确定终的GSH / GSSG比。查看更多

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百萤课堂：如何确定荧光分子的亮度？百萤课堂：如何确定荧光分子的亮度？今天百萤为大家介绍一个非常实用的小技巧，用于确定荧光分子的亮度。如果你想选购一种荧光探针，而你已经确切的了解到了几种探针均可以满足你的实验要求，但是，哪一个才是荧光强度好的呢？求人不如求己，实验还得靠自己！今天小萤告诉你之后，请收藏好它！ ________________________________________ 荧光分子的亮度取决于两个因素： 1. 消光系数（ε):荧光分子吸收特定波长的光的强度。 2. 荧光量子产率（Φ）:吸收光转换为发射光的效率。有小伙伴要问了，知道了消光系数和荧光量子产率又该怎么办呢？请记住以下公式：亮度=消光系数（ε） x 荧光量子产率（Φ）实例验证:大家对于PE、APC、Cy5应该都是比较熟悉的。 ? PE = 1,960,000 cm-1M-1 （ε)x 0.84（Φ） = 1646400 ? APC = 700,000 cm-1M-1 （ε)x 0.68 （Φ）= 476000 ? Cy5 = 250,000 cm-1M-1 （ε)x 0.20 （Φ）= 50000 现在相信大家不用我说，也能看出哪个更亮了吧！那有小伙伴又要问了，可是荧光探针那么多，我找不到确切的消光系数和荧光量子产量啊！别着急，下面是我们为您总结好的常用的产品消光系数和荧光量子产率请收好！产品名称消光系数（ε）cm-1M-1 荧光量子产率（Φ）备注 iFluor 350 20000 0.95 在水性缓冲液中（pH=7.2） iFluor 405 37000 0.91 iFluor 430 40000 0.78 iFluor 450 40000 0.82 iFluor 488 75000 0.9 iFluor 514 80000 0.83 iFluor 532 90000 0.68 iFluor 546 100000 0.67 iFluor 555 100000 0.64 iFluor 560 120000 0.57 iFluor 568 100000 0.57 iFluor 594 180000 0.53 iFluor 610 110000 0.85 iFluor 633 250000 0.29 iFluor 647 250000 0.25 iFluor 660 250000 0.26 iFluor 670 250000 0.63 iFluor 680 220000 0.23 iFluor 700 220000 0.23 iFluor 750 275000 0.12 iFluor 790 250000 0.13 iFluor 800 250000 0.11 iFluor 810 250000 0.05 iFluor 820 250000 N/D iFluor 840 200000 0.02 在PBS中产品名称消光系数（ε）cm-1M-1 荧光量子产率（Φ）备注 Alexa Fluor 488 73000 0.92 缓冲液（pH=7.2） Alexa Fluor 532 81000 0.61 Alexa Fluor 546 112000 0.1 Alexa Fluor 568 88000 0.69 Alexa Fluor 594 92000 0.66 Alexa Fluor 647 270000 0.33 Alexa Fluor 660 132000 0.37 Alexa Fluor 680 183000 0.36 Alexa Fluor 700 205000 0.25 Alexa Fluor 750 290000 0.12 产品名称消光系数（ε）cm-1M-1 荧光量子产率（Φ）备注 Cy3 150000 0.04 Cy3B 120000 0.58 Cy3B酸 120000 0.58 Cy5 250000 0.27(PBS)/0.4(乙醇) Fluo-4 82000 0.16 Fluo-8 23430 0.16 Cal-590 78000 0.62 7-AAD 27500 0.02 在双链DNA结合的情况下 AFC 17000 0.53 在乙醇中 Hoechst 33258 46000 0.034 SYTO 17 88000 0.964 SYTOX绿色 67000 0.53 在DNA中 JOJO-1 171000 0.44 在DNA中 ________________________________________ 百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商，为您提供AAT Bioquest优质的产品、详尽的技术和前沿的资讯，欢迎来电咨询！查看更多

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简介

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个人简介：天津百萤生物科技有限公司（Tianjin Biolite Biotech Co., Ltd）成立于2011年，由多位海外留学归来的学者创立。百萤生物围绕荧光标记、荧光探针、核酸/蛋白标记等技术进行产品研发，公司产品广泛用于细胞器染色、细胞凋亡研究、细胞信号通路研究、细胞及线粒体膜电位检测、活体示踪、抗体标记等科研领域。公司推出的EB替代染料-TJ系列染料，细胞增殖检测检测试剂盒等明星产品，获得国内外客户高度评价。美国AAT Bioquest Inc是生物光谱领域的全球领导者，AAT 产品帮助全世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学，更高效的筛选新药。作为AAT Bioquest在中国的唯一战略合作伙伴，百萤生物将与AAT优势互补，为国内外客户提供光谱学检测、底物显色、荧光和发光技术等全系列解决方案。色彩让科学更生动，我们期待与您的合作。查看更多

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