ANTI-CDC34的应用及其相互作用蛋白的研究? ANTI-CDC34是一种免疫抗体,可以特异性结合CDC34,并用于多种免疫学实验,如Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等。 人类基因组编码了两个E1酶、至少38种E2酶和超过600种不同的E3酶。其中最大的E3酶家族是cullin-RING连接酶(CRLs),最初被发现为多亚基Skp1-Cdc53/Cullin-F盒蛋白(SCF)泛素连接酶。SCF复合物包含核心亚基Skp1、Cdc53/Cul1和Rbx1/Roc1/Hrt1,以及一组称为F box蛋白的衔接子亚基,它们可以募集特定底物至核心复合物。 除了SCF复合物外,还有其他基于类似衔接子-cullin-RING结构的SCF样复合物,如Cul2、Cul3、Cul4A、Cul5和Cul6等泛素连接酶。因此,CRL类具有靶向数百种甚至数千种蛋白质降解的能力。CDC34是编码蛋白质的基因之一。 CDC34与多个途径相关,包括TCR信号传导和CLEC7A(Dectin-1)信号传导。与CDC34相关的基因本体论(GO)注释包括连接酶活性和泛素连接酶结合。CDC34在控制细胞周期和DNA复制中起着重要作用。与不同的E3复合物(包括SCF)相关的Cdc34已被证明在细胞分裂、信号转导和发育过程中靶向许多不同的底物进行泛素化和降解。 已经确定的Cdc34底物包括IκB、B-Myb、Wee1、MyoD、ICERIIα、ATF5、p27Xic1和p27Kip1等。此外,由于SCF对蛋白水解的要求,Cdc34的推定底物还包括β-连环蛋白、p21Cip1、E2F、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白D。Cdc34通过其C末端的结构域自缔合,并且在体内被磷酸化和泛素化。该蛋白质可用于体外泛素化反应。 如何调控CDC34活性及其相互作用蛋白的研究方法 为了探索CDC34活性位点的调控及其相互作用蛋白,研究人员对CDC34的活性位点进行了点突变,并研究了突变体对自身泛素化和稳定性的影响。同时,利用LC-MS/MS技术寻找CDC34相互作用蛋白,并对这些蛋白进行了验证和相互调控关系的研究。 研究方法包括构建带有Strep-FLAG标签的野生型CDC34和突变型CDC34 C93S质粒,在HEK293T细胞中表达野生型和突变型CDC34,并通过蛋白免疫印迹检测它们的表达情况。同时,利用免疫沉淀的方法纯化与CDC34相互作用的蛋白,并通过银染和LC/MS-MS分析酶解后的多肽来鉴定这些蛋白。最后,通过生物信息学分析这些蛋白的功能,并通过蛋白印迹验证它们与CDC34的相互作用及调控关系。 研究结果及意义 研究结果表明,CDC34C93S突变体显著抑制了自身的泛素化修饰,从而增加了其稳定性。此外,CDC34C93S突变体还能增加部分相互作用蛋白的稳定性。通过质谱分析鉴定到了与CDC34相互作用的蛋白质,如MCM7、PRKDC和GNL3,并发现CDC34能够上调MCM7的水平,下调GNL3的蛋白水平。 参考文献 [1] Jessica S.Brown, Stephen P.Jackson. "Ubiquitylation, neddylation and the DNA damage response." Open Biology. 2015(4). [2] Wei Kang, Joanna Tong, Anthony Chan, Alfred Cheng, Jun Yu, Kafai To. "MCM7 serves as a prognostic marker in diffuse-type gastric adenocarcinoma and siRNA-mediated knockdown suppresses its oncogenic function." Oncology Reports. 2014(5). [3] Chanlu Xie, Chris Powell, Mu Yao, Jianmin Wu, Qihan Dong. "Ubiquitin-conjugating enzyme E2C: A potential cancer biomarker." International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2014. [4] Randy Suryadinata, Jessica K.Holien, George Yang, Michael W.Parker, Elena Papaleo, Boris Sarcevic. "Molecular and structural insight into lysine selection on substrate and ubiquitin lysine 48 by the ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34." Cell Cycle. 2013(11). [5] 刘勋. "CDC34活性半胱氨酸对自身稳定性的调控及CDC34相互作用蛋白的鉴定与功能研究." 苏州大学, 2016.查看更多
如何使用四硫磺酸盐煌绿增菌液基础进行沙门氏菌选择性增菌培养? 四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB)是一种用于沙门氏菌选择性增菌培养的培养基。它需要添加煌绿和碘液。 这种培养基的原理是:蛋白胨和牛肉膏粉提供碳源、氮源和维生素,满足细菌生长的需求;氯化钠可以维持均衡的渗透压;碳酸钙可以中和细菌产生的酸和吸收有毒的代谢产物;硫代硫酸钠和四硫磺酸钠结合可以抑制肠道共生菌,而具有四硫磺酸钠还原酶的细菌可以在这种培养基中繁殖;胆盐和煌绿可以抑制大肠杆菌和其他革兰氏阳性细菌。 四硫磺酸盐煌绿增菌液基础的应用 用于牦牛沙门氏菌分离鉴定方法及流行病学研究 牦牛是青藏高原特有的物种,对当地牧民来说具有重要的生产和生活价值。牦牛沙门氏菌病在牧区长期流行,导致牦牛严重的下痢和死亡。目前,国内外对其他动物源的沙门氏菌进行了较多的研究,但对牦牛沙门氏菌的研究报道较少。由于粪便是沙门氏菌的主要来源,为了从源头控制沙门氏菌的传播,对体表健康牦牛粪便中的沙门氏菌进行监测具有重要的公共卫生学意义。 本研究对体表健康牦牛粪便中的沙门氏菌进行了分离鉴定方法及流行病学研究。 实验结果表明,在2010年采集的26份牦牛粪便中,使用三种选择性增菌液TTB、SC、MSRV和三种选择性培养基XLD、SS、CAS,比较了9种分离方法对牦牛粪便中沙门氏菌分离的影响。结果发现,使用TTB增菌液和SS培养基的组合可以获得最高的分离率,为8/26。总共检测到13头牦牛携带沙门氏菌,通过比较发现,使用TTB增菌液和MSRV增菌液的组合以及CAS培养基和SS培养基可以获得最高的分离率,为12/26。 此外,根据国内外文献报道,比较了以invA、invE、stn、16S、bidui基因为检测靶点的5种PCR方法。对48株牦牛沙门氏菌进行了鉴定,结果显示这5种PCR方法的检出率均为100%,因此这5种方法可以用于牦牛源沙门氏菌的快速检测。参照Liu B等人建立的沙门氏菌血清群PCR快速检测方法,对48株牦牛沙门氏菌进行了检测,共鉴定出9株血清B群、1株C1群和37株D群,证明该方法适用于牦牛沙门氏菌血清群的PCR快速检测。 参考文献 [1] Evaluation of three commercial enzyme‐linked immunosorbent assays for the detection of antibodies against Salmonella spp.in meat juice from finishing pigs in Spain[J].J.P.Vico,B.Engel,W.G.Buist,R.C.Mainar‐Jaime.Zoonoses and Public Health.2010 [2] Comparison of Bacterial Culture and Real‐Time PCR for the Detection of Salmonella in Grow–Finish Pigs in Western Canada Using a Bayesian Approach[J].Zoonoses and Public Health.2010 [3] Control of Salmonella pathogenicity island-2 gene expression[J].Ephraim Fass,Eduardo A Groisman.Current Opinion in Microbiology.2009(2) [4] Characterisation of antibiotic resistance in host-adapted Salmonella enterica[J].Aaron M.Lynne,Lindsay L.Dorsey,Donna E.David,Steven L.Foley.International Journal of Antimicrobial Agents.2009(2) [5] 朱晓霞.牦牛沙门氏菌分离鉴定方法及流行病学研究[D].西南民族大学,2012. 查看更多