如何进行融合 His Tag 重组蛋白的纯化过程? 为了获得大量融合 His Tag 的重组蛋白用于开发复性方法,我们利用PCR技术扩增了大肠杆菌DH5α染色体DNA中苹果酸脱氢酶的编码基因、质粒pEGFP-C1中增强型绿色荧光蛋白的目标基因以及牛胰腺全DNA组中核糖核酸酶A的DNA。然后,我们通过酶切位点Bam HI和HindIII将这些基因与质粒载体pET28a连接,构建出重组质粒pET28a-MDH、pET28a-EGFP和pET28a-RNase A。 将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,得到可以启动T7 promoter表达目标蛋白质的基因工程菌。通过优化表达菌的培养时间和诱导时机,我们确定了最佳诱导条件。对表达产物的分析发现,目标蛋白主要以包涵体形式存在,但也有部分可溶蛋白表达。经过SDS-PAGE凝胶电泳胶密度面积扫描分析,我们得到了目标蛋白的产量。 如何进行融合 His Tag 重组蛋白的亲和分离? 由于表达产物带有6个His Tag,我们利用固定化金属亲和色谱(Chelating SepharoseTM Fast Flow)对表达产物进行了亲和分离和复性的前期实验。结果表明,固定化金属亲和色谱能够较好地吸附可溶性表达蛋白质和经脲变性的包涵体蛋白质,并且可以通过结合/洗脱缓冲液有效洗脱,实现较好的分离纯化效果。 参考文献 [1] 融合 His Tag 重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化查看更多
防御素的重要性及应用? 防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子蛋白,广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物和植物中。它们是宿主防御肽,对细菌、真菌和病毒具有活性。防御素通过破坏微生物细胞膜的结构起作用,形成孔状膜缺陷,从而杀死病原体。越来越多的证据表明,防御素在防御病原体方面发挥着重要作用,被认为是先天免疫反应的一部分。 防御素在人体中分布广泛,由白细胞和多种上皮细胞分泌。它们在舌头、皮肤、角膜、唾液腺、肾脏、食道和呼吸道等部位都可以找到。一些研究认为,囊性纤维化的发生可能与肺和气管上皮表面的防御素活性受到抑制有关。 防御素的应用 重组小鼠BD-14可以用于研究非分型流感嗜血杆菌的抗菌活性。通过基因工程方法获得的重组小鼠BD-14在体外实验中显示出明显的抗菌活性,对非分型流感嗜血杆菌具有抑制作用。 参考文献 [1] Pearce G, Yamaguchi Y, Munske G, Ryan CA (December 2008). "Structure-activity studies of AtPep1, a plant peptide signal involved in the innate immune response". Peptides. 29(12): 2083–9. [2] Thomma BP, Cammue BP, Thevissen K (December 2002). "Plant defensins". Planta. 216(2): 193–202. [3] Barrera GJ, Sanchez G, Gonzalez JE (November 2012). "Trefoil factor 3 isolated from human breast milk downregulates cytokines (IL8 and IL6) and promotes human beta defensin (hBD2 and hBD4) expression in intestinal epithelial cells HT-29". Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 12(4): 256–64. [4] Barrera GJ, Tortolero GS (2016). "Trefoil factor 3 (TFF3) from human breast milk activates PAR-2 receptors of the intestinal epithelial cells HT-29, regulating cytokines and defensins". Bratislavske Lekarske Listy. 117(6): 332–9. Lehrer RI (September 2004). "Primate defensins". Nature Reviews. Microbiology. 2(9): 727–38. [5] Varkey J, Singh S, Nagaraj R (November 2006). "Antibacterial activity of linear peptides spanning the carboxy-terminal beta-sheet domain of arthropod defensins". Peptides. 27(11): 2614–23. [6] Varkey J, Nagaraj R (November 2005). "Antibacterial activity of human neutrophil defensin HNP-1 analogs without cysteines". Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49(11): 4561–6. Zhu S, Li W, Jiang D, Zeng X (July 2000). "Evidence for the existence of insect defensin-like peptide in scorpion venom". IUBMB Life. 50(1): 57–61. [7] Zhu S, Peigneur S, Gao B, Umetsu Y, Ohki S, Tytgat J (March 2014). "Experimental conversion of a defensin into a neurotoxin: implications for origin of toxic function". Molecular Biology and Evolution. 31(3): 546–59. [8] Dhople V, Krukemeyer A, Ramamoorthy A (September 2006). "The human beta-defensin-3, an antibacterial peptide with multiple biological functions". Biochimica et Biophysica Acta. 1758(9): 1499–512. 查看更多