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实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 原理的主要步骤实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针，当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。 RT-qPCR 原理的三个主要步骤： 1 反转录： · 使用逆转录酶和特定引物将 RNA 样品反转录成 cDNA 。 · 该步骤将 RNA 模板转化为更稳定且可扩增的 DNA 形式。 · 反转录过程中使用特定引物。 2 PCR 扩增： · 使用特定引物对 cDNA 进行 PCR 扩增，这些引物环绕目标区域。 · PCR 是一个循环过程，呈指数级扩增 DNA 模板的数量。 · PCR 反应中包含荧光染料或探针，它们结合到扩增的 DNA 序列上并发出荧光信号。 3 荧光实时检测： · 使用实时 PCR 仪器实时监测荧光信号。 · 荧光的数量与每个 PCR 循环中扩增的 DNA 数量成比例。 · 使用专业软件分析数据以确定循环阈值（ Ct ）值，该值表示荧光信号达到特定阈值水平所需的循环数。 Ct 值用于计算原始样品中存在的目标 DNA 量，从而允许进行基因表达或病毒载量等定量分析。查看更多

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PCR检测试剂盒实验反应条件有什么 PCR检测试剂盒实验反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。查看更多

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标准物质的作用具体有什么？标准物质又称参考物质（Reference Material，RM）：具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期用途。标准物质的作用：我国的计量技术规范JJF 1507-2015 《标准物质的选择与应用》中则将标准物质的作用归纳为五点，以下将加以详细说明介绍： 1、校准现代仪器技术发展为化学分析者提供了高灵敏度、高专一性、高精密度的分析方法，这些方法基本都需通过校准物的信号与被分析物信号比较来确定被分析物的量，有证标准物质因此成为校准链上的重要一环。《计量法实施细则》中明确规定标准物质属于计量器具的一种，其也成为法定计量检定机构用来复现、保存和量值传递的计量标准器。标准物质通过不间断的校准链，以相对直接的方式实现测量结果对选定参考对象的计量溯源性，可保证检定、校准结果的准确、可靠、有效。 2、建立计量溯源性实际测量中，通过使用不同等级的标准物质，按准确度由低到高，逐级进行量值的追溯，直到国际基本单位SI，这个过程实现了量值的“溯源”。而若从国际基本单位出发，用不同等级的标准物质由高至低进行量值传递，最终至实际测量现场的过程，则被称为量值的“传递”。通过标准物质的使用，最终形成化学测量完整的溯源一量传体系。 3、为其他材料赋值有证标准物质常可用于材料赋值。如果赋值过程中用到的相关设备经过适当校准，并采取了充分的质量保证与质量控制措施，就有可能通过该有证标准物质建立特性值对规定测量单位的计量溯源性。在化学成分量测量领域，常使用标准物质通过混合、稀释等手段制备其他工作用标准物质或校准物，这些物质的特性值及不确定度取决于所使用标准物质，并受制备程序和环境条件的影响。此外，标准物质还可以通过经典称量滴定法或容量滴定法分析为其他材料赋值。 4、测量方法/程序确认标准物质作为特性量值已知的物质，可用于研究和评价测量成分或特性的方法，判断该方法的准确度和重复性。有证标准物质可用于测量正确度确认，亦可用于其他确认目的，借此有效建立测定结果的计量溯源性。质量控制物质或其他未经定值的标准物质可用于方法确认，但由于特性值缺少计量溯源性，因此仅适合评估与精密度相关的量度。通过验证和改进测量方法的准确度，评价检测方法在特定场合的适应性，从而促进校准方法和测试技术的发展，已有很多单位将标准物质应用于标准方法的制定和实施过程中。 5、测量质量控制标准物质可以为日常实验室质量控制指标如测量精密度、测量偏倚或回收率、灵敏度等提供均匀、稳定的样品，另外，利用标准物质开展的实验室间比对活动，也是一种有效的实验室外部质量控制手段。在缺乏合适基体的标准物质或考虑标准物质使用成本的情况下，可由实验室或具有同样要求的用户群自行制备质量控制标准物质。必要时，可运用有证标准物质为实验室制备的质量控制标准物质赋值或提供计量溯源性保证。查看更多

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影响ELISA测定的外源性物质浅析外源性物质经常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。 1、标本溶血由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注重避免溶血。 2、标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 3、标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。 4、标本凝集不全在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后1/2~2h开始凝固，18~24h完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 5、标本管中添加物质的影响抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。综上所述，对临床检验ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。查看更多

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PCR检测试剂盒设计引物应遵循原则有什么？设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。查看更多

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PCR温度与时间如何设置？ PCR 温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子 70℃ 60 核苷酸/S/酶分子 55℃ 24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时， DNA 合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。查看更多

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简介

职业：上海西格生物科技有限公司 - 经理

学校： -

地区：上海市

个人简介：上海西格生物科技有限公司（ Shanghai Sig Biotechnology Co., Ltd）是一家生物企业,主要从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的销售。主营产品:生化试剂、试剂盒、ELISA试剂盒、抗体、重组蛋白、生化检测试剂盒、分光光度法检测试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒、细胞株、原代细胞、细胞培养基、标准溶液产品。代理并销售进口SIGMA试剂、abcam抗体、R&D抗体、CST抗体、ATCC细胞、BD公司、GE公司、赛默飞世尔公司产品。上海西格生物科技有限公司（ Shanghai Sig Biotechnology Co., Ltd）先后与天津中医学院、复旦大学、上海交通大学医学院、上海交通大学、华东师范大学、第二军医大学、南京大学，暨南大学，南京工业大学，曙光医院、华山医院、瑞金医院、上海有机研究所、中科院上海分院等多家单位建立了良好的合作关系。本公司可为您提供科研 ELISA试剂盒，种属标本齐全,有专门针对人血清、血浆、全血、分泌物、尿液、细胞培养上清液、组织匀浆、组织液等标本的试剂盒；另有针对各种动物（鼠、兔、牛、马、鸡、猪、狗、山羊、猴、鱼）的科研试剂。公司秉承 “专注品质、信守承诺、积极沟通、创新服务”的企业文化积极参与生物领域的技术创新和技术服务，力求为我国科研事业更好的，更专业的服务！公司售后服务宗旨 :有质量问题可申请退换，有技术疑问可随时给于解答，一对一的客服服务，客户的需求也是我们不断的更新服务。查看更多

企业简介

企业名称：上海西格生物科技有限公司

企业性质：代理商,

主营业务：生化试剂，标准品,对照品，PCR试剂盒，核酸检测试剂盒，荧光定量检测试剂盒，生化试剂盒，比色法试...

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