如何制备热稳定无机焦磷酸酶并提高PCR扩增效率?

在生物体内，核酸的合成会产生焦磷酸盐，而焦磷酸酶可以分解焦磷酸盐，避免其累积对生物体产生负面效应。然而，在PCR反应中，焦磷酸的累积同样会降低扩增效率并影响荧光染料的稳定性。

为了解决这个问题，人们添加无机焦磷酸酶到PCR反应中，将焦磷酸水解为正磷酸，从而增加反应混合液的pH值并提高荧光染料的稳定性。然而，由于PCR反应的高温要求，这种焦磷酸酶必须能耐受95℃的高温。

为了满足这一要求，研究人员重组表达了嗜热栖热菌HB27株的PPase基因，该酶具有较高的热稳定性。基于这个基因，构建了一种改造的热稳定无机焦磷酸酶，可以应用于需要更多循环数和反应时间的超敏PCR扩增，从而提高扩增效率。这种热稳定无机焦磷酸酶具有增强DNA复制的特点，并且在100℃加热4小时后仍具有100%的活性。

制备热稳定无机焦磷酸酶的方法是将原酶的氨基酸序列进行改造，改造后的酶具有更高的热稳定性。具体的改造方法包括改变氨基酸T为S、E为K、L为I或V为I、D为A、A为Q或K等。通过人工合成对应的碱基序列，扩增构建表达载体，并进行蛋白纯化。

参考资料

[1] CN201710017276.4 一种改造的热稳定无机焦磷酸酶