FFPE 样本（石蜡样本）要求 A. 组织固定要求（FFPE 蜡块与 FFPE 切片一样） a) 组织离体时间：缺血离体时间不宜超过1小时，组织块离体后应尽快固定 b) 组织固定液：推荐10%NBF或4%PFA,10%NBF穿透力强，4%PFA穿透力弱一些 c) 固定时间：根据组织块大小而不同，0.5cm直径组织块一般18-24小时。固定时间不宜太长，例如几天，几周，甚至几个月 B. FFPE蜡块要求（如果客户送蜡块样本） a) 组织固定需符合A中的要求 b) 存放条件：将蜡块放入干燥器中，保持干燥环境，室温保存。干燥器如下图所示 c) 蜡块年龄：小于3年的蜡块nanostring做过实验验证没有问题，3-10年的蜡块nanostringTAP项目做过类似服务可以得到比较理想结果，超过10年的蜡块需要客户自行验证蛋白 与 RNA 的完整性 d) 蜡块切片要求：由于蜡块表面的空气氧化，所以开始的几张切片不用于实验，挑选远离蜡块表面的切片 e) 切片厚度：5μm f) 组织切片位置：组织切片需位于载玻片中央 C. 切片要求（如果客户送切片样本） a) 组织固定需符合A中的要求 b) 蜡块的保存与年龄需符合B中的要求 c) 切片厚度：推荐5μm，越薄越好 d) 组织切片位置：组织切片需位于载玻片中央（下图绿色矩形区域，左边为载玻片磨砂区域） e) 切片存放条件：将切片放入干燥器中，保持干燥环境，放置4度或室温保存 f) 切片有效时间：我们推荐使用新鲜切片，保存时间需小于 14 天 ? FF 样本（冰冻样本） 要求 A. FF样本块要求 a) 组织块离体后应立即用液氮或者异戊烷速冻 b) 速冻后的组织块需用OCT包埋剂包埋 c) 包埋后的组织块需在负80度保存 B. FF样本切片要求 a) FF切片需要冷冻切片机上完成 b) 切片后应立即贴片至载玻片中 c) 切片厚度：推荐5μm，越薄越好 d) 组织切片位置：组织切片需位于载玻片中央（下图绿色矩形区域，左边为载玻片磨砂区域） e) 切片后，FF组织块切口出需用OCT包埋剂覆盖，防止组织块干燥 f) 切片可在负80度保存数周 查看更多
如何进行ROI的圈选呢？ DSP支持5种圈选策略: ① 几何圈选：评估不同组织区域的组织异质性，按照特定的几何形状圈选目标区域，正方形，圆形，几何图形都可以 ② 细胞亚型分选：从复杂组织中实现对细胞亚群或特定组织区域精细识别和精准分析 ③ 等高线圈选：使用从中心区域辐射的等高线形状评估邻近区域如何影响生物过程和表达变化趋势 ④ 网格分析：使用可调的网格模式进行全面、深度的空间定位分析 ⑤ 稀有细胞圈选：在细胞类型特异的形态学标记指导下圈选组织中离散的特定细胞，揭示不同细胞亚群的信号通路和功能 其中几何圈选和细胞亚型分选是最常用到的两种圈选策略，具体如何圈选主要取决于研究者的研究目的，需要具体问题具体分析。需要注意的是，对于DSP转录组项目而言，每个ROI/AOI中至少包含100-200个细胞，对于DSP蛋白组项目而言，每个ROI/AOI中至少包含50个细胞，细胞数过少会导定量不准确或者建库失败 DSP区域圈选方式 查看更多
ROI和AOI的区别是什么？ ROI全称是Region of Interest，即感兴趣的区域，也就是在DSP工作流程的第二个步骤“区域挑选”中目标圈选的区域。AOI全称是Area of Illumination，本质和ROI一样都是感兴趣的区域，只是在DSP中二者有一定的层级关系，当我们对所选感兴趣区域（ROI）进一步基于区域内部不同形态学特征做分割时，从区域中分割出来的小的区域就被称之为AOI 查看更多
DSP技术的工作流程是怎样的？ 主要包含以下五个步骤： ① 染色&孵育：利用标准IHC方法，将成像试剂（荧光标记的抗体/探针）、定量试剂（DSP条形码标记的抗体/探针）和组织切片进行混合杂交和染色。支持在组织切片上预染1-4个荧光抗体或荧光探针，展现切片的形态学特征，有助于预先筛选目标研究区域，因此荧光染料又被称为形态学marker ② ROI圈选：ROI即感兴趣的区域，是DSP流程中十分重要的流程，决定了后续检测的组织区域。同时，可根据形态学marker进行进一步AOI的Segmentation ③ UV切割：目的是释放RNA探针或蛋白抗体上连接的寡核苷酸标签序列 ④ 标签收集：收集释放的寡核苷酸标签序列进行定量 ⑤ 定量：对收集的寡核苷酸标签序列进行PCR扩增建库，加上测序接头，通过UMI对标签去重，通过probe ID与探针文库比对明确标签对应的基因，最终完成表达定量 DSP工作流程示意图 查看更多
第1天
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