胞浆蛋白提取试剂盒的应用及操作方法? 胞浆蛋白提取试剂盒是一种用于提取哺乳动物组织和细胞中胞质蛋白的试剂盒。该试剂盒中的裂解液含有温和的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,可用于获得蛋白,并可应用于免疫印迹实验等基础研究实验。然而,由于含有酶抑制剂,不能用于研究蛋白激酶和磷酸激酶。 如何操作胞浆蛋白提取试剂盒? 1、提取组织总蛋白 在1ml的冷裂解液中加入10ul的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF,混匀后放置在冰上备用。取0.1g新鲜组织放入玻璃匀浆器中,用眼科剪将组织块剪碎,然后加入0.5-1ml新配置的裂解液,冰上操作下研磨至无明显组织块。将组织匀浆液转移到1.5ml的EP管中,以4°C 12000g离心30min,吸取上清液进行蛋白定量或变性蛋白实验。 2、提取细胞总蛋白 裂解液的用量:107个细胞需要1ml裂解液。 贴壁细胞:弃去培养基,用冷的PBS洗两次细胞,加入计算好的细胞裂解液,用细胞刮刀刮离细胞,将刮离的细胞裂解液转移到EP管中,在冰上颠倒裂解20-30min。 悬浮细胞:用冷的PBS洗两次细胞,以4°C 400g离心收集细胞,加入裂解液涡旋10s,放置冰上裂解10min,重复3-4次。裂解完毕后,以4°C 12000g离心30min,将上清液移入新的EP管中,进行蛋白定量或变性蛋白实验。 胞浆蛋白提取试剂盒的应用 胞浆蛋白提取试剂盒在系统性红斑狼疮兔模型研究中的应用 为了建立经济、稳定、简便、可重复性强的系统性红斑狼疮兔模型,以便于今后进一步研究SLE的发病机制和治疗学。选取1岁龄体重约2.5kg的雌性新西兰白兔50只,随机分为5组,每组10只。提取同种异体肝脏细胞核蛋白及细胞浆蛋白,设首次注射时间为第0天,于第0天及第1、2、4、6、8、10、12周末予实验组兔蛋白提取物500μg/次(浓度为:1 mg/ml),其中,实验组1皮下注射肝细胞核蛋白,实验组2皮下注射肝细胞浆蛋白,实验组3经静脉注射肝细胞浆蛋白;相同时间点予对照组1皮下注射等体积PBS,予对照组2静脉注射等体积PBS。 实验组1、2及对照组1首次注射时将抗原制剂与完全弗氏佐剂等体积乳化。从第1周开始至第18周末,每两周采集各组兔血液,并以特制兔体液收集代谢笼收集各组兔24小时尿液。观测各组兔血液中的生化指标和24小时尿液中的蛋白含量;使用ELISA法测定各组兔血清中的ANA、抗dsDNA抗体和抗Sm抗体。在第18周末处死所有实验动物。 对皮肤组织进行HE和免疫组化染色;对肾脏组织进行HE染色、Masson染色和免疫组化染色,并对肾脏和皮肤病变的严重程度和范围进行半定量分级。 参考文献 [1]New Animal Models for Autoimmune Hepatitis[J].Urs Christen,Edith Hintermann,Elmar Jaeckel.Semin Liver Dis.2009(03) [2]Lupus-like autoantibody development in rabbits and mice after immunization with EBNA-1 fragments[J].Brian D.Poole,Timothy Gross,Shannon Maier,John B.Harley,Judith A.James.Journal of Autoimmunity.2008(4) [3]Genetic contributions to the autoantibody profile in a rabbit model of systemic lupus erythematosus(SLE)[J].Nandakumar Puliyath,Satyajit Ray,Jacqueline Milton,Rose G.Mage.Veterinary Immunology and Immunopathology.2008(3) [4]Expression and localization of rabbit B-cell activating factor(BAFF)and its specific receptor BR3 in cells and tissues of the rabbit immune system[J].Jiahui Yang,Richard Pospisil,Rose G.Mage.Developmental and Comparative Immunology.2008(5) [5]罗彦彦.肝细胞核蛋白及胞浆蛋白诱导建立的系统性红斑狼疮兔模型[D].广西医科大学,2011.查看更多
标准绵羊血清(碳吸附过滤)的作用是什么? 背景 [1-3] 标准绵羊血清(碳吸附过滤)是经过血浆凝固后,在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。它在细胞培养中起到提供营养物质、激素和生长因子、结合蛋白、促接触和伸展因子以及保护细胞的作用。 标准绵羊血清(碳吸附过滤)经过无菌采集、批量混合,并经过3次0.1um过滤分装,以去除有害物质。它适用于单抗研制、原代和传代细胞培养以及规模化培养的疫苗生产。 碳吸附过滤根据吸附过程中活性炭分子和污染物分子之间作用力的不同,可分为物理吸附和化学吸附。物理吸附主要与活性炭的物理性质有关,而化学吸附则与活性炭和污染物之间的化学键有关。 碳吸附型血清是一种低水平类固醇类的血清产品,通过碳吸附可以降低血清中许多激素和生长因子的浓度。它适用于那些需要这些分子的细胞培养,但可能会降低细胞生长性能。 应用 [4][5] 用于Lnc-SEMT促进绵羊肌肉分化生成的功能研究 通过高通量测序的方法,筛选出了一种可以促进绵羊肌肉细胞分化和成肌生成的LncRNA分子(命名为Lnc-SEMT)。研究发现,Lnc-SEMT对骨髂肌的发育具有重要调控作用。这项研究对于揭示动物肌细胞增殖和分化的分子机制,以及肉羊分子辅助育种和开发促生长制剂具有重要意义。 1. 通过对胚胎期90口和120日龄绵羊背最长肌样品进行高通量测序,共计得到1114个lncRNA,其中466个lncRNA差异表达,其中157个lncRNA上调,309个lncRNA下调。 2. 通过对测序得到的1114个lncRNA进行芯片验证,发现有867个预测的lncRNA存在,其中有119个lncRNA的表达上调。对这119个lncRNA进行定量筛选后,得到了一个在骨骼肌组织中特异性高表达的上调LncRNA(命名为Lnc-SEMT)。 3. 通过检测绵羊不同生长时期的Lnc-SEMT表达水平,发现在胚胎期120日龄时,其表达量最高,出生后逐渐降低,成年后表达水平变化不大。 4. 通过检测绵羊成肌细胞生长分化过程中的lncRNA表达量变化,发现在成肌细胞分化0-5天内,随着成肌细胞的生长分化,MYOG和MYOD基因表达水平也随之升高。 5. 构建了Lnc-SEMT的高表达和干扰载体,分别转染到绵羊成肌细胞。通过DAPI和MyHC试验分析,结果表明随着成肌细胞分化过程中Lnc-SEMT的过表达和干扰,MYOG、MYOD等基因的表达也随之变化。 参考文献 [1] Systematic Characterization of Long Non-Coding RNAs Reveals the Contrasting Coordination of Cis-and Trans-Molecular Regulation in Human Fetal and Adult Heart[J]. Chunjiang He, Hanyang Hu, Kitchener D. Wilson, Haodi Wu, Jing Feng, Siyu Xia, Jared Churko, Kun Qu, Howard Y. Chang, Joseph C. Wu. Circulation: Cardiovascular Genetics. 2016. [2] A Micropeptide Encoded by a Putative Long Noncoding RNA Regulates Muscle Performance[J]. Douglas M. Anderson, Kelly M. Anderson, Chi-Lun Chang, Catherine A. Makarewich, Benjamin R. Nelson, John R. McAnally, Prasad Kasaragod, John M. Shelton, Jen Liou, Rhonda Bassel-Duby, Eric N. Olson. Cell. 2015(4). [3] From Discovery to Function: The Expanding Roles of Long NonCoding RNAs in Physiology and Disease[J]. Miao Sun, W. Lee Kraus. Endocrine Reviews. 2015(1). [4] New insights into polar overdominance in callipyge sheep[J]. C.A. Bidwell, J.N. Waddell, T.M. Taxis, H. Yu, R.L. Tellam, M.K. Neary, N.E. Cockett. Anim Genet. 2014. [5] 吴明明. Lnc-SEMT促进绵羊肌肉分化生成的功能研究[D]. 中国农业大学, 2016.查看更多