2-氨基-4-甲氧基吡啶是什么？ 介绍 2-氨基-4-甲氧基吡啶（2-Amino-4-methoxypyridine）是一种吡啶类的有机化合物，化学式为C6H8N2O。外观呈现为灰白色固体。它在DMSO（二甲基亚砜）和甲醇中溶解，微溶于水。它对空气敏感。它是一种重要的有机合成中间体，常用于合成手性药物分子、生物活性分子以及含氮配体。它可以在适当的条件下通过酰化反应将分子骨架连接到目标分子中去。此外，它还可以在氨基的对位引入卤素原子，如溴或碘。 图一 2-氨基-4-甲氧基吡啶 合成 将密封管中4-氯吡啶-2-胺（10 g，78.1 mmol）在甲醇钠溶液（50 mL，1M溶液）中的溶液在145°C下加热6小时。真空浓缩溶剂，得到残余物，通过硅胶色谱法纯化，用DCM中的10%甲醇洗脱，得到7.7 g，79%产率的化合物2-氨基-4-甲氧基吡啶，为灰白色固体[1]. 图二 2-氨基-4-甲氧基吡啶的合成 将4-甲氧基-吡啶-2-羰基叠氮化物在无水甲苯中的溶液回流过夜，然后真空除去甲苯。将残余物溶解在四氢呋喃中，并加入氢氧化钾水溶液（5.0eqiv，10N）。将反应混合物在室温下搅拌5h，然后在二氯甲烷和盐水之间分配。二氯甲烷提取物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩。通过柱色谱法纯化，得到化合物2-氨基-4-甲氧基吡啶[2]. 图三 2-氨基-4-甲氧基吡啶的合成2 将2-氨基-4-氯吡啶（970mg，7.18mmol）溶解在50mL甲醇中。通过向搅拌的溶液中加入钠（450mg，19.6mmol）原位制备甲醇钠。然后将反应混合物在回流下搅拌48小时。TLC对照表明完全转化。然后将反应混合物冷却至室温。通过加入10%盐酸水溶液将pH值调节至pH 8。在真空中除去溶剂，将剩余的残余物重新悬浮在乙醚中，过滤除去不溶性成分。在真空中除去溶剂。产量511mg，57.4%[3]. 图四 2-氨基-4-甲氧基吡啶的合成3 参考文献 [1]FOREMAN ,Kenneth,W., et al.BCR-ABL TYROSINE-KINASE LIGANDS CAPABLE OF DIMERIZING IN AN AQUEOUS SOLUTION, AND METHODS OF USING SAME[P].WO2015US11271,2015-07-16. [2]DING ,Ke,WONG , et al.4H-Pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one derivatives as modulators of the estrogen-related receptors[P].EP09797343,2014-11-05. [3]Alkenes; Findings from Graz University of Technology Reveals New Findings on Alkenes (A convenient synthetic route to substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines via a novel ethylene-bridged compound)[J].Chemicals & Chemistry,2015,查看更多
半胱胺酸蛋白酶蛋白-12抗体的应用及其对糖尿病大鼠心肌细胞的影响？ 背景 [1-3] 半胱胺酸蛋白酶蛋白-12抗体是一种多克隆抗体，能够特异性结合半胱胺酸蛋白酶蛋白-12，并广泛应用于体外检测半胱胺酸蛋白酶蛋白-12的免疫实验。 半胱氨酸蛋白酶（Caspases）是一类半胱氨酸蛋白酶家族，对于细胞的程序性死亡或凋亡起着重要作用，是活细胞通向死亡的关键因素。半胱氨酸蛋白酶的活化受到多种刺激的调控，包括配体-受体相互作用、生长因子剥夺和细胞功能抑制剂等。 所有已知的半胱氨酸蛋白酶都需要在天冬氨酸附近发生裂解，释放出一个大亚基和一个小亚基，然后这些亚单位结合成a2b2四聚体形成活性酶。 半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、L等，在溶酶体中广泛存在，主要参与细胞吞噬和细胞内多余物质的清除和消化。近年来，组织蛋白酶B（Cathepsin B，CB）的作用受到了广泛关注。在正常组织中，CB在酸性条件下活性最高，而在中性或碱性条件下无活性。然而，在肿瘤组织中，CB在中性或碱性条件下的活性更高，这似乎更适合于恶性肿瘤的代谢紊乱。 CB能够降解Ⅰ型胶原、LN、PG，并能够活化间质胶原酶原和Ⅳ型胶原酶原，从而降解基质中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型胶原纤维，参与肿瘤的浸润转移。 应用 [4][5] α-硫辛酸对糖尿病大鼠内质网应激相关分子GRP78和Caspase-12表达的影响 本研究旨在探讨α-硫辛酸（alpha lipoic acid,A-LA）对内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）介导的糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响。 实验采用SD大鼠，随机分为3组：对照组、糖尿病模型组和α-硫辛酸组。通过一次性注射链脲佐菌素（60 mg/kg）在左下腹腔建立大鼠糖尿病模型。 α-硫辛酸组每天按照60mg/kg的剂量灌胃，对照组和糖尿病组每天灌胃等量的0.9%氯化钠注射液。在12周后，检测血糖和心功能状态；使用原位末端转移酶标记技术（TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）检测细胞凋亡；使用Western Blot和免疫组织化学法检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和半胱胺酸蛋白酶蛋白-12（Caspase-12）的蛋白表达水平。 结果显示，与对照组相比，糖尿病模型组大鼠的血糖明显增高（P<0.05），心功能受损；而α-硫辛酸组对糖尿病大鼠的血糖和心功能有一定程度的改善。与对照组相比，糖尿病组大鼠的心肌细胞凋亡明显增加（P<0.05），GRP78和Caspase-12的蛋白表达也增加。而α-硫辛酸组的心肌细胞凋亡明显降低，GRP78和Caspase-12的蛋白表达有所减少。 结论：α-硫辛酸对糖尿病心肌组织具有保护作用，其机制可能与降低GRP78的表达、拮抗Caspase-12以及阻断ERS启动的凋亡通路有关。 参考文献 [1] Ferri K F, Kroemer G. Organelle-specific initiation of cell death pathways. Nature Cell Biology. 2001. [2] Min N, Amy SL. ER chaperones in mammalian development and human diseases. FEBS Letters. 2007. [3] Szegezdi E, Logue SE, Gorman AM, et al. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. EMBO Reports. 2006. [4] Paschen W, Mengesdorf T. Cellular abnormalities linked to endoplasmic reticulum dysfunction in cerebrovascular disease-therapeutic potential. Pharmacology and Therapeutics. 2005. [5] 王国贤, 李瑞芳, 商淑慧, 李飞, 李兆刚, 刘珊珊. α-硫辛酸对糖尿病大鼠内质网应激相关分子GRP78和Caspase-12表达的影响[J]. 解放军医学院学报, 2013, 34(01): 82-85.查看更多
如何构建稳定细胞株并实现目的蛋白过表达? 稳定细胞株的构建对于各种研究应用非常重要，例如重组蛋白和抗体生产、基因编辑以及功能性研究等。构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，然后将载体转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，最后利用载体中所含的抗性标志进行筛选。常用的抗性筛选标志物有新霉素、潮霉素和嘌呤霉素，其中G418常用于选择性筛选。通过这种方法可以得到稳定表达目的蛋白或者沉默特定基因的细胞株。 构建稳定细胞株的过程需要经历多个步骤，其中细胞转染是非常关键的一步。常用的转染方法包括物理方法（如电转）、化学方法（如脂质体）以及生物方法（如病毒）。根据实验条件的不同，选择最适合的方法来达到实验目的。 目的蛋白的过表达是研究基因/蛋白功能的常规手段之一，也可以通过表达系统富集蛋白的方法（如DHFR、GS系统）来得到大量的目的蛋白。构建蛋白过表达稳定细胞株可以很好地帮助研究该蛋白的功能。 构建稳定细胞株的主要步骤是什么？ 主要步骤包括： 1. 载体构建（表达质粒载体、病毒载体）； 2. 转染/感染； 3. 目的蛋白初步检测； 4. 抗生素筛选； 5. 目的蛋白再次检测（定性/半定量）； 6. 单克隆细胞株稳定性检测。 如何利用慢病毒法构建表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株？ 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是真核细胞信号传导的重要通路，其中p38作为该家族的亚族之一，在细胞内参与应激反应、增殖、凋亡等多种生物学过程。研究发现通过p38MAPK通路诱导前列腺癌细胞凋亡可以治疗前列腺癌。 为了研究p38MAPK的功能以及为未来治疗靶点的研究提供工具，可以将外源性的p38MAPK导入细胞内，并使细胞稳定持续表达。在将外源基因转入宿主细胞并使其表达的过程中，选择合适的携带载体非常关键。目前常用的基因转导载体包括病毒载体和非病毒载体。其中，慢病毒载体具有转导分裂细胞和非分裂细胞的能力，能够实现长期而稳定的基因表达，并且不会引起宿主免疫反应。 在前列腺癌的动物实验中，常用的方法包括荧光蛋白法和生物发光法来监测肿瘤细胞或者肿瘤组织的发生发展过程。荧光蛋白作为报告基因在细胞内分子影像领域具有广泛的应用。 参考文献 [1] Applications of bioluminescence imaging to antiviral research and therapy: multiple luciferase enzymes and quantitation. Luker K E, Luker G D. Antiviral Research. 2008. [2] A capsid-modified helper-dependent adenovirus vector containing the beta-globin locus control region displays a nonrandom integration pattern and allows stable, erythroid-specific gene expression. Wang H, Shayakhmetov DM, Leege T, et al. Journal of Virology. 2005. [3] Firefly luciferase and RLuc8 exhibit differential sensitivity to oxidative stress in apoptotic cells. Czupryna J, Tsourkas A. PLoS One. 2011. [4] A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Puaux A L, Ong L C, Jin Y, et al. Int J Mol Imaging. 2011. [5] 荆玉明. 慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株[D]. 南方医科大学, 2012. 查看更多
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