想用内参检测下上样量是否相等，可是没找到合适的蛋白做内参？我做过不少膜蛋白，由于当时没有经典的内参NA/ K ATPASE，为了省时、省钱，试着用了beta－axtin做内参，条带很清楚，我们用的beta-actin抗体还是国产的。我们抽提膜蛋白用的是pierce经典的kit，应该说膜蛋白提取的效果比较不错。所以依然能做出来β－actin。所以我认为：1.膜蛋白纯度不可能100％纯的，肯定含有胞浆或者亚细胞器蛋白。2.β－actin表达量本身丰富、结构和理化性质稳定，所以很容易做出来。3.楼主也说了有这样的文章用了β－actin做内参来做膜蛋白的，即使出发点不是用来做内参而是为了验证纯度。这从侧面反应了很难去除beta－actin。基于上述三点：我认为实际是可以用beta－actin来做内参，2. 我支持β-actin 和GAPDH是在胞浆中表达的，膜中应该不含有该成分，故不能用来做内部参照，可以用来检测所提的膜蛋白是否纯，我们提取膜蛋白， 无论是物理方法（密度剃度离心， 双水相）还是化学方法（各种公司的KIT）， 提取的膜蛋白都不可能是完全纯的， 能够达到60-70%都是相当不错的了， 更不要说我们所希望得到的细胞质膜可能还包括了细胞中的亚细胞器的膜， 所以孵育得到条带是完全可能的。至于质膜的标识蛋白， 也就是NA/K ATP酶（一种整合膜蛋白）， 这个也是没有疑问的（各种integrin也算）至于是否能做内参就看你是不是在变化过程中让这些蛋白与你的体系一同变化了， 如果有， 那就是内参， 如果体系不同， 互相不影响， 那就只能算外参了。提供一篇文献参考， 用的是NA/ K ATPASE，Quantitative analysis of Na, K-ATPase immunoreactivity in normal, BPH and PCa canine prostate. Panel A; results of image analysis experiments performed in triplicate comparing Na, K-ATPase expression levels in tissue sections immunoassayed with a polyclonal antibody to the α1 subunit of Na, K-ATPase under identical experimental conditions. Panels B and C; representative sections used for analysis. Panels D and E; plot profiles of Na, K-ATPase abundance in the BPH and PCa sections. 查看更多
第1天
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