人髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒的应用及操作步骤? 背景信息 人髓过氧化物酶(MPO)ELISA试剂盒是一种用于测定标本中人髓过氧化物酶(MPO)水平的双抗体夹心法。该试剂盒利用纯化的人髓过氧化物酶(MPO)捕获抗体制成固相抗体,通过与HRP标记的检测抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过洗涤后加入底物TMB显色。通过测定吸光度(OD值)并参考标准曲线,可以计算样品中人髓过氧化物酶(MPO)的含量。 操作步骤 1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;样本孔加待测样本50μL。 3. 样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。 4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次。 6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。 应用研究 基于家蚕-杆状病毒表达系统制备人髓过氧化物酶的研究 该研究通过将人髓过氧化物酶MPO的cDNA克隆到带有6个组氨酸的供体质粒上,获得含人MPO基因的重组供体质粒。然后在大肠杆菌BmDH10Bac中和家蚕杆状病毒基因组杆粒(Bacmid)于转座子(Tn7)上发生转座,通过蓝白斑筛选出带有目的基因的克隆。随后在家蚕BmN细胞中制备含人MPO基因的重组病毒。最终通过镍-柱亲和层析结合离子交换层析的方法进行分离纯化,获得目的产物人髓过氧化物酶。 研究结果表明,重组人MPO能够在家蚕体内得到很好的表达和包装,蛋白质翻译后的(糖基化)修饰良好,分离纯化后的蛋白比活性达396.7±41.7 milliunits/mg,并且能够被病人阳性血清所识别。 利用家蚕-杆状病毒表达系统在五龄家蚕中制备的人重组MPO具有与来源于人嗜中性粒细胞表达的MPO相当的比活性,且表达量高。平均每条蚕可制备高达1.7微克左右的目的蛋白。此方法具有成本低的优势,避免了昆虫细胞培养所需的昂贵培养基和胎牛血清,且家蚕饲养简单方便。 参考文献 [1] The role of neutrophils in causing antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated vasculitis[J]. Adrian Schreiber, Mira Choi. Current Opinion in Hematology. 2015(1). [2] MultiBac turns sweet[J]. Dieter Palmberger, Miriam Klausberger, Imre Berger, Reingard Grabherr. Bioengineered. 2013(2). [3] Genetic modification of a baculovirus vector for increased expression in insect cells[J]. Richard B. Hitchman, Robert D. Possee, Andrew T. Crombie, Adam Chambers, Kim Ho, Evangelia Siaterli, Olga Lissina, Heather Sternard, Robert Novy, Kathryn Loomis, Louise E. Bird, Raymond J. Owens, Linda A. King. Cell Biology and Toxicology. 2010(1). [4] Signal peptide design for improving recombinant protein secretion in the baculovirus expression vector system[J]. Mutsumi Futatsumori-Sugai, Kouhei Tsumoto. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009(1). [5] 陈俏梅. 基于家蚕-杆状病毒表达系统制备人髓过氧化物酶的研究[D]. 江苏大学, 2016. 查看更多