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为什么要对胎牛血清内毒素格外留意? 养过细胞的童鞋大都有着这样的共识：血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的必备营养，也是细胞死亡的致命“毒药”，远慕生物为您分析为什么要对胎牛血清内毒素格外留意。有下列情况者，对胎牛血清内毒素应格外留意筛选： 1.养干细胞时，干细胞对内毒素非常敏感，如果血清中内毒素≥3EU/ml时，干细胞很容易死亡。很多使用者，在血清在试用前，就通过提早审核该批次《检测报告》，以决定是否入围进行试用。 2.养免疫细胞时，过高的内毒素可诱导免疫细胞释放炎症因子，抑制小鼠红细胞集落的形成等。 3.基因敲除相关的细胞实验，培养的细胞要尽可能保持其原始状态，任何引导细胞衰老或凋亡的试剂，都会让后续的实验结果“失之毫厘，谬以千里”。在准备血清和其他试剂时，选择极低的内毒素（最好≤1EU/ml），对实验至关重要； 4.原代培养、杂交瘤融合、细胞转染，或者肝细胞、神经细胞、内皮等难养细胞的扩增，这些都需要挑选好的血清给细胞以有力支持。因此，挑选geng低的内毒素，是保证实验顺利的第一步。 5.实验室有些细胞，需要长期培养、长期冻存，或者经常复苏、经常培养的，血清会经常或长时间作用于细胞。为保证细胞的健康，都应该选用geng低内毒素的血清，以避免内毒素长久对细胞的毒性影响。总之，血清中内毒素含量过高，geng容易导致细胞“亚健康”，造成数据不准，或细胞状态不良、老化、甚至死亡，导致试验中断失败。血清中的内毒素越低越好。全球细胞培养学会均依据内毒素对血清的品质进行分级和命名。内毒素含量越低的血清，级别就越高，以胎牛血清为例：当血清中内毒素含量≤10EU/ml时，此血清为特级胎牛血清；当血清中内毒素含量﹥10EU/ml，≤ 25EU/ml时，此血清为优级胎牛血清；当血清中内毒素含量≥ 25EU/ml时，此血清为标准级胎牛血清；目前，由于同一厂家，不同批次的血清，内毒素数值也可能有较大差异，因此很多血清厂家在名称上已不注明级别。但使用者仍可通过检测报告，自行甄别挑选。查看更多

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细胞转染率低转染试剂要全背锅吗? 目前细胞转染技术主要分为三大类：化学法、物理法及生物学法。但是没有一种方法是通用并且准确无误的，所以只有依据自己的实验要求或者实验探索选择理想的方法，才能获得漂亮的实验结果。当然也可以在前辈们发的文献中多看看，前车之鉴可以减少很多不必要的花费。细胞转染低都是PCR试剂的问题吗？PCR纯度不够确实会有这样的问题，所以选择PCR试剂很重要主要还是以下几点影响： 1. 其他微生物污染您觉得您养的细胞，不，不，不，可能您只知道您养的是细胞，你不知道的是您的细胞可能背着您养了一群小三，比如支原体，病毒，黑胶虫等等，特别是支原体它可以更改细胞的特性，穿透细胞膜进行基因改造，培养几代可能看不到“它”给细胞做的整容效果，但是随着代次的增多，细胞就慢慢体现出来了，“它”已经变得不是从前的那个“它”了，所以建议在转染之前进行一次支原体检测，如有支原体清除干净再转染。 2.交叉污染：如果同时养了很多细胞，在操作的时候没有规范化，然后不小心让A细胞到B细胞家里走了个亲戚，最后的结果可能就是A细胞和B细胞不离不弃，若B细胞比较强悍，可能会发生鸠占鹊巢的事情。所以操作的时候一定要注意，发生不明确的交叉污染，宁可错杀一千，不要放过一个。 3.转染高不高，时机很重要转染细胞真的没有那么容易，想什么时候都可以，就像不尿急，占个厕所也拉不出来，相比非分裂的细胞—正在分裂的细胞往往会比静止细胞更容易摄取并表达外源DNA，因此对大多数操作而言，细胞一般建议在转染当天或者前一天种板，需要注意的是，铺板细胞不宜过多，特别是疯长的癌细胞，因为如果细胞较多，甚至互相叠加，细胞自己都吃不饱，住不好，它也糟心的很，哪有时间和您玩转染？ 4. 抗生素和血清带偏的转染效果本来想，能让个细胞好好生长不容易，为了防治心里觉得细胞可能产生的各种污染，于是给他们加上各种抗生素预防，比如青霉素和链霉素，在细胞转染的时候，若含有这两个组分，可增加细胞的通透性，导致转染过低或者细胞全死亡，所以细胞它是不会说话，要是会说话，肯定要骂我们了，好好的一直给他们吃各种的药。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在的情况下效率会很低，因此转染前要去除血清。Cell systems原代细胞采用无抗体洗涤离心分选，可以让细胞实验更为精-确，使用他们的细胞发表的文献影响因子在10分以上。 5. 另外DNA不纯，携亲戚上阵或内毒素超标，都会引起转染效果偏低或者细胞死亡现象的发生，选择试剂很重要查看更多

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蛋白质纯度分析方法介绍? 在评价样品纯度之前，首-先需要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在特定溶液条件中, 能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化特性 (化学分析或物理特征）。而纯度则是指待测杂质含量低于某个特定水平。需要注意的是，上述说明中并没有要求描述杂质的性质。纯化过程可能已将某一杂质的浓度降低到检测下限以下，但色谱峰中还有残留。毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。由于大多数分离方法都能够有效地去除非蛋白质类杂质，因此本文将主要介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法。目前有一些高灵敏度的方法可用于检测样品中的杂质。其中每种方法测定分子的一种特定物理特性。方法的选择依赖于以下标准:①可用于检测的蛋白质的量；②待测杂质的性质;③所需的检测精度;④所需的检测灵敏度;⑤可能干扰到该方法的蛋白质及其溶剂特性。蕞为简单和常用的方法是，经一次或多次分离后证实只有一种组分可被检测到。若纯度标准为只可以存在一种可检测物质，则需用多种分离手段检测杂质。当所选择的某种检测方法无法从主要分析物中分辨出一种未知杂质时，推荐使用正交的方法 (orthogonal)。蕞后，谨慎处理样品非常重要，这样可以防止在制备分析所用的样品过程中改变其杂质谱。并且，洁净的环境、适宜的温度及适当材质的容器都会为分析提供帮助。一、蛋白质的组成和活性分析一些方法能够量化氨基酸、特定辅基团或活性位点的摩尔数，可以用来评价蛋白质样品的纯度。如果已知纯蛋白质的活性，那么单位活性测量可以用来检测相对纯度。这些方法是间接的，因为总要将分析物假设为不含杂质的纯品，并将该假设纯品的量作为参照。这些方法主要适用于纯化过程早期的多相系统，或适用于需要特殊环境来保持活性的分子 (如膜蛋白）。一般需要检测两项: 第1项是分析所用样品中蛋白质 (或原料）的总量; 第二项是定量已知的活性对象或其他特殊的分析对象。然后根据蛋白质的总量，计算出相应的预期分析对象的量。纯度则以分析对象的测定量和预期量的比值表示。使用末端基团分析法（Chang,1983)、特殊辅助基团定量分析法和酶活定量分析法（Biggs，1976) 等都可以非常好的量化纯度。二、电泳法电泳法提供了蕞简单、成本蕞低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度蕞高的手段，因此蕞为常用。由于成本极低且相当简单，这些方法常被用做蛋白质纯度第1步筛选，甚至应用于初期高异质性的样品。本书中其他章节介绍了 SDS 凝胶电泳以及利用电泳测定分子质量和大小的方法 (Rhodesetal.,2009)。这些方法都可以单独测定样品的纯度，方法的选择取决于希望检测待测蛋白质的何种性质 (表 38.1)。如果预期杂质与目标蛋白质分子质量有差距，SDS 凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子质量相近但氨基酸组成不同的分子，SDS 凝胶电泳一般不能区分，但是在非变性凝胶电泳中它们有不同的电泳迁移率。另外，几乎任何大小的蛋白质都可以通过等电聚焦法分离。有关等电聚焦法在本书的其他章节中有所介绍 (Friedman,2009), 这里不做详述。根据采用的电泳检测方法的类型, 所需样品量从纳克级到微克级。由于每种杂质在特定样品中占据固定的质量分数 (weightfraction)，而杂质的检测依赖于其总量，因此上样量过载的胶也许能够更有机会检测到某种杂质。然而，样品上样量的上限取决于样品溶解度，并且需要基于分辨率的考虑 (Lunneyetal.，1971)。一般后者的限制性更强，因为样品浓度较高或者大体积样品量会导致谱带扩张和变形。由于过载造成的谱带扩张将难以分辨具有相似电泳迁移率的杂质。然而，电泳这种蕞灵敏的谱带检测方法 (需要的样品量蕞小) 不适于回收样品。如果蛋白质样品已变性或者已在极端条件下溶解，一般很难再回收活性蛋白质。如果使用的是非变性电泳，则可通过电泳提取（electirophoreticextraction) 从凝胶中回收样品（Friedman,2009;Garfin,2009)。但是变性电泳可能无法回收天然蛋白质。复性成功与否很大程度上取决于蛋白质的结构。较大或多亚基的蛋白质恢复天然构象的可能性比小单体蛋白质要小。三、色谱法 1.凝肢过滤色谱法凝胶过滤色谱法是检测与目的分子大小不同的杂质的蕞简单方法之一。这一方法无破坏性并且非常快速。因为这是一种「区带方法」(zonalmethod), 样品通过凝胶柱时会被稀释, 因此需设置恰好高于蕞小检测限度的起始浓度。而确切使用量则取决于用本方法检测杂质时的灵敏度。四、沉降速率测定法沉降速度法 (sedimentationvelocitymethod) 能够简单快速且非破坏性的来评价一个蛋白质的纯度，这种方法对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。关于沉降速率测定法在 Rhodes 等 (2009) 的文献中有简要介绍。一般来说，当使用沉降速率测定法来检测蛋白质纯度时，实验者能够找到的沉降组分不止一种。该方法的优点在于测定的材料范围非常广 (尤其是使用折射式光学系统时），但蕞大的局限在于，它对分子质量相差小的样品的灵敏度不如电泳技术，甚至区带沉降 (bandsedimentation) 也不可避免这种问题。五、质谱法由于质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布，因此这种方法能够非常简便、灵敏地测定杂质。质谱不仅可以检测杂质的存在，还可以描述杂质的质量特征，因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。除了能够直接测定蛋白质分子质量大小，通过串联质谱 (MS,’MS 或 MS2) 法，如碰撞诱导解离（collisioninduceddissociation，CID)、电子转移解离（electrontransferdissociation，ETD)、电子捕获解离（electroncapturedissociation，ECD) 及红外多光子解离（infraredmultiphotondissociation，IRMPD) 等，还可以鉴定共价改性修饰特征和位点。其中，CBD 和 IRMPD 可以测定相当小的蛋白质 ( 由于杂质可能与主要分析物有相同的质荷比，因此将质谱法与其他分离方法联用可以增加样品纯度测定的准确度。例如, 如果在凝胶排阻层析的洗脱峰中出现不对称峰，质量检测将帮助区分其是由大小不同的杂质所导致，还是由于自身相关的分子所导致。不同于光散射法基于回转半径 rg(theradiusofgyration) 测量而计算质量，质谱法对蛋白质的质量测量更加准确。六、光散射法如 Rhod=等 (2009) 所述，目前一些仪器能够进行静态或动态光散射来测定单个样品，或者监控高效液相色谱和场级 (FFF) 分离过程。通过对分子大小和表观分子质量的连续测定，增强了鉴定洗脱蛋白质的能力，能够区别待分析物、待分析物多种形式的聚集体或杂质。光散射法非常简单且无破坏性，并且目前的仪器能够提供一个洗脱时间函数的分子质量图。这样，如果一个紫外线检测峰不对称，多角度光散射 (multipleanglelightscattering，MALS); 也称多角度激光散射 (multipleanglelaserlightscattering,MALLS) 分析结果则可能表现为峰的主要部分的表观分子质量为 mol/L，而边缘为 2mol/L, 这说明可能存在二聚体。需要注意的是，倍数分子质量的存在并不证明一定存在自身结合，还需采用不同的方法验证该结果。尽管 MALS 结果不如质谱准确，但是所需的设备更便宜且操作简单。查看更多

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免疫组化如何选择使用封闭血清? 做免疫组化时，一般都会封闭。以减少假阳性。封闭主要是用于封去切片上一些非特异性吸附。用一种非特异性的蛋白，把那些容易吸附蛋白的空间和位点占起来，这样，加上抗体时，抗体只能与对应的抗原去结合了。一般封闭可以用5%的BSA，这个价格便宜，而且效果还行。但理论上，用与二抗同来源的正常血清会更好。比如，一抗为国产的兔抗IL-2，二抗用标记的羊抗兔IgG。那么，封闭血清就选择与二抗同来源的正常羊血清（一般为山羊）。而同理，如果一抗为羊抗IL-2，二抗可以选标记的兔抗羊IgG，封闭血清选择正常兔血清。使用时，可以用PBS将正常血清稀释20倍，直接滴加在切片上，37℃度10-30分钟，直接甩掉，不洗，轻轻的吸一下旁边的液体，再加一抗。听说4℃过夜比起37℃两小时背景会干净一些。当然，时间也会长一些。免疫组化中的血清封闭原理先加一抗后再封闭的话，一抗就会结合到固相表面上，这种结合力是非特异性的疏水作用力，这种作用力是比较强的，经过处理的固相表面如硝酸纤维膜，酶标板对蛋白的吸附力更强，你再去封闭就没有作用了。当然，也不是说封闭蛋白就完全不会封闭掉一抗的蛋白结合位点，在蛋白过量的条件下，蛋白质之间会有黏附和堆积作用，但这种作用通常是不稳定的。如果你所选择的一抗与固相抗原亲和力较高，在适合的buffer条件下，一抗会竞争它的结合位点。蛋白质之间那点黏附和堆积作用力当然竞争不过它啦。 " 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5~1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%~5% 牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 10~20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清 (非免疫的)。有明显溶血的血清不能" "对消除背景的非特异性染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。" "抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。这种反应没有化学键的形成。抗原-抗体的结合是可逆的“查看更多

#封闭血清

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如何配制干粉培养基? 注意事项 1. 干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 2. 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 3. 配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 4. 所用器皿应严格消毒。 5. 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。 6. 液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。配制方法 1. 在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5%的双蒸水。 2. 在室温(20℃到30℃)的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。 3. 水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。 4. 加NaHCO3到培养基中。 5. 用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 6. 通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3。培养基在过滤前要保持密封。查看更多

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医学微生物学实验室规则你知道吗? 医学微生物学实验室是一个病原微生物高度集中的场所，其实验对象大都是病原微生物，有传染的危险。为了防止病原微生物感染自身、污染环境以及扩散传播，要求同学们进入微生物学实验室必须严格遵守以下规则：一、进入实验室必须先穿本室的实验服，必要的实验指导、书籍和文具带入后，应放在实验台下的抽屉里，其它个人物品如书包、衣物等一律不得带入实验室。二、实验室内禁止饮食、吸烟、用嘴湿润铅笔或标签、以手抚摸头面部等等行为。三、每项微生物学实验，都要坚持无菌操作，既要防止临床标本及纯培养物被污染，更要防止临床标本或纯培养中的病原微生物感染人体或污染环境。四、用过的吸管、滴管、试管、玻片等带菌器材，应放在指定的地方或含消毒液的容器内，不得放在桌面上或水池内，亦不得将带菌液体倾入水槽。酒精灯不可互相点燃，以防发生意外。五、若发生割破手指、菌液进入口、眼，或遇带菌材料破损，污染环境、物品等事故时，应立即报告老师，及时进行预防处理。六、不可擅自搬动示教、实验器材或室内设施。爱护公物，节约使用实验材料。如有损坏，应立即向指导教师报告，主动在破损物品登记本上登记，某些物品需按规定酌情赔偿。七、实验完毕，应清理桌面，把用过的物品放回原处（如显微镜、接种环、染色液、擦镜纸、香柏油、火柴等），需培养的物品按要求放入温箱。八、离开实验室前，应脱下实验服，反折放入抽屉内，在消毒液中将手浸泡5～10分钟，并用自来水冲洗干净后，方可离室。九、值日生负责整理清洁实验室（包括桌面、地面、实验设备等），然后关好水、电、门、窗，脱衣洗手后离室。十、未经许可，不得将实验室内任何物品（特别是菌种）带出室外。查看更多

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科研人一定要了解的抗体保存方法！? 抗体由于性质和所使用的储存条件等各有不同，其保质期可能从几周到几年。抗体能否正确保存，直接决定了抗体的活性和使用效果。每个抗体有其独特的保存最佳条件，但我们依然可以总结抗体保存的一般准则以及一些注意事项。抗体必须存放在适当的温度和pH值范围。为了维持蛋白质的活性，以及防止其聚集，经常保存在一定浓度的甘油，蔗糖，或类似的物质里面。如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。 1. 抗体保存要点（1）收到抗体后需先在 12000 rpm 离心 1-5 分钟，再打开管盖进行分装和保存，如果抗体体积不足50 ul，可延长离心时间至 5 分钟，从而确保抗体全部离心下来。（2）对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃或-80℃，也可4℃短暂保存1-2周，并不影响抗体活性。 ①对绝大多数抗体来说，保存在-20℃即可。如果抗体在2周内会使用，推荐在4℃保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则最好是在-20℃或-80℃。当然最关键的是按照说明书的推荐来进行保存。但是，腹水形式的产品收到后需立即冻存，因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4℃保存会导致抗体的降解。 ②分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。复融后的分装抗体如果一次用不完，需将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来。 ③抗体工作液应该当天配制当天用完，在4℃尽量不要超过1天。 ④尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上。且避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。（3）大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。4℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害，如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程。所以运输过程中避免干冰运输。 2. 抗体保存示例 (1)多克隆抗体多克隆抗体在血清中于-20℃保存十年其活性损失不大。然而，一旦抗体被纯化后，储存在50%的甘油中于-20℃保存，即使没有冻融，其活性的损失也可以观察到，尽管其进程仍然非常缓慢。即使没有甘油，只要你不反复冻融，抗体也可以存储在-20℃几年甚至几十年。此外，该抗体浓度应高于1mg/ml，因为稀的抗体容易失去活性而且容易造成物理吸附导致的损失。 (2)单克隆抗体单克隆抗体可以加入50％的甘油存放于-20℃。也可4℃或-20℃保存于饱和硫酸铵中。一般不会出现失活、细菌滋生以及氧化等现象。而冻干法（冷冻干燥，干燥或从冰冻状态）为一些冰冻以后不稳定抗体提供了一种替代的保存方法。在大多数情况下，冻干的抗体最好是存放在-20℃。但冻干法需要昂贵的设备和劳动力。 (3)带标记的抗体带标记的抗体一般储存在黑色容器中或者用锡箔纸包裹。 ①酶标记抗体碱性磷酸酶和其他酶结合物对于冷冻特别敏感，一般应在4°C短期存储。标记抗体长期保存最好是在终浓度为50％的甘油或乙二醇中于-20°C保存。虽然某些酶结合物可在无保护剂的情况下于-20°C储存，但必须分装，以防止反复冻融。 ②荧光标记抗体荧光遇光容易分解，荧光标记的试剂（不只是抗体）必须避光保存，其应该存放在4°C，避免让其凝固。 3. 抗体保存其它相关信息： (1)甘油保存有些科研工作者会向抗体中加入50%的甘油来避免反复冻融，甘油在-20℃会降低冰点。这对很多抗体可能是可行的。加入甘油的溶液不建议在-80℃保存，因为这已经超过了甘油的冰点。如果需要加入甘油来保存抗体的话，请注意无菌操作，避免污染。 (2)蛋白保护剂蛋白在高浓度时更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），这就是为什么在抗体中加入 BSA 之类作为稳定剂的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，则不能加入蛋白稳定剂，因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。 (3)关于叠氮化钠（sodium azide）的使用为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中（终浓度 0.02% (w/v)）。但在下述情况中不能使用叠氮化钠： ①如果抗体用于染色或处理活细胞，用于体内研究：叠氮化钠在抵抗微生物的同时，对其它大部分有机物也是有毒的，因为它阻断了线粒体的 cytochrome electron transportsystem。 ②要偶联带有氨基基团的抗体：叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01％。对于需要偶联的抗体，thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂。此外，如果需要去除叠氮化钠，可以通过凝胶电泳或过滤的方式，IgG 的分子量是 150kDa，叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除。查看更多

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天然培养基与合成培养基的区别在哪? 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。一、血清(serum) 细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是蕞为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。 1.血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。牛血清是细胞培养中用量蕞大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质蕞高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分蕞少。 2.血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要是：（1）血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；（2）血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；（3）不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限。天然培养基/液的种类很多，包括生物性液体（如血清）；组织浸液（如胚胎浸液）；凝固剂（如血浆）等。天然培养基的特点及存在的问题：组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基，如蛋白水解物、血清等。其优点是含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，缺点是其为成分不明确的混合物，受其来源及法规等问题的限制，制作过程复杂，批次间差异大，并逐渐被合成培养基所取代。实际工作中往往将天然培养基与人工合成培养基结合使用。常见有水解乳蛋白和新生牛血清。合成培养基是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。查看更多

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凝胶过滤需注意那些? 1.层析柱的选择层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。 2.凝胶柱的鉴定凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。 3.洗脱液的选择由于凝胶过滤的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶过滤中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶过滤洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶过滤的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。 4.加样量关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%－5%左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10%－25%。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过（Ve1－Ve2）。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。 5.洗脱速度洗脱速度也会影响凝胶过滤的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶过滤的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶过滤要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的，各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以选择最合适的实验条件。查看更多

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蕞小抑菌浓度（MIC）及抑菌率的测定? 提纯蛋白质后，需要测定其最小抑菌浓度（MIC），有文献提到根据MIC测得的结果计算抑菌率：抑菌率（%）= (阳性对照OD值—试验OD值) / (阳性对照OD值—阴性对照OD值 )X100 样品的MIC与同性质药物和一些常用药物的MIC进行比较才有意义，不能单纯通过自己样品的结果就判断出高低，并且不能只用一种细菌。要考虑用不同种类的细菌进行实验，还要做质控。根据抑菌率大小可以判断是否具有抑菌能力。可参考以下药敏介绍：诸多药敏试验方法中，肉汤稀释法是标准方法，琼脂稀释法也可认为属于标准方法。其他任何方法必须与标准方法比较，才能确定可靠性。其他方法之间相互比较没有太大价值。比较须平行测定耐药菌株和敏感菌株。耐药菌株，被评价方法与标准方法的误差称极重要误差，不得大于3%；敏感菌株，被评价方法的误差称重要误差，不大于7%。不同的药敏试验方法，针对不同药物，可靠性不一样。如测MRSA须高盐条件，有的试剂盒中不加盐，结果不准确，但这不影响肠球菌的测定结果。所以，评价一种方法，应该是有针对性地验证一种细菌对一种药物测定结果的可靠性。质量控制及其校准作用 1、纸片法药敏试验用敏感菌株做质量控制。此外，ATCC25923，ATCC25922，ATCC27853三个菌株还具备校准作用，此点往往被忽视。在NCCLS有关文件中，质量控制一节的第一部分就是讲方法的校准。由于培养基和操作的原因，国内大部分实验室的药敏试验没有经过校准，试验的准确度差异很大。校准过程中，须注意用适合的参考菌株校准相应菌类的药敏试验。如葡萄球菌药敏试验用ATCC25923校准；肠杆菌药敏试验用ATCC25922校准。 2、筛选法药敏试验必须用耐药菌株做质量控制，最好是低水平耐药菌株。MRS筛选试验以ATCC43300控制。万古霉素筛选试验，以ATCC51299控制。 3、稀释法药敏试验对质量控制要求较高，特别是微量稀释法，必须做质量控制，否则会出现较大误差。具体方法须依照NCCLS文件的有关部分。与不同的菌种和不同的药物，breakpoint 是不一样，对于抗菌实验和结果解释，不同的国家有不同的标准，目前国际上最常用的是美国CLSI的标准，差不多每年都会有更新。其次英国的BSAC标准也有人用，尤其是有些新药在CLSI上没有的，可以参考BSAC，相对于CLSI， BSAC breakpoint 更低一些。查看更多

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如何检测新鲜的培养基是否有支原体污染? 把新鲜的培养基放在 CO 2 培养箱中培养 48 小时（样品），吸取一定的上清进行检测。如果样品的颜色变成天蓝色或者出现 PCR 扩增条带，则证明含有支原体污染。查看更多

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化学试剂取用有哪些要求? 在实验室中用到蕞多的就是化学试剂了，分为固体试剂和液体试剂，气体的化学试剂需要临时的设备。我们在取用任何化学试剂的时候都禁止用手取用，不能闻气味，更不能尝试味道。试剂瓶塞或瓶盖打开需倒放在桌子上，取用试剂后立刻盖好瓶塞或者瓶盖。当试剂会受到污染或者变质不能使用。下面古朵生物就为大家讲解一下。固体试剂的取用 1、粉末状或者颗粒试剂、使用药勺，用量多瓶口大的可选用大号药勺。 2、用量小或者容器口径小的可选用小号药勺。尽量吧试剂送入容器底部，粉末状试剂容易散落或沾到容器口和容器壁上。也可将试剂倒在折成槽型纸条上，在将容器放平，槽纸沿器壁伸入底部、竖起容器轻抖纸槽。 3、块状固体使用镊子，送入容器时，需容器倾斜放置，沿器壁慢慢滑入容器底部。 4、取用过试剂的镊子或者药勺务必擦拭干净、不能一匙多用，用后也应擦拭干净不留残物。 5、固体试剂称量，需要注意不要多取，取多的试剂，不可倒回原瓶。已经于空气接触的试剂有可能受到污染，倒回去容易污染瓶里的试剂。 6、固体试剂可以放在干净的纸或者平面器具上称量。具有腐蚀性，强氧化或者易潮解的固体试剂不能放在纸上称量，应放在玻璃容器内称量， 7、实验中若无规定剂量时，所取试剂量以能刚刚盖满试管底部为宜。 8、有-毒的试剂称取需要做好防护措施，如戴口-罩、手套等。液体试剂取用注意事项： 1、用少量液体试剂时，可用胶头滴管吸取，用量较多可倾到。 2、从滴瓶中取液体试剂，滴管决不能伸入所用的容器中，以免接触器壁污染试剂，取少量的液体试剂时，则需要专-用滴管，装有试剂的滴管不得横着或滴管口向上斜置，以免液体滴入滴管叫皮帽中，腐蚀胶皮帽，再次取试剂时受到污染。 3、从细口瓶中将液体倾倒入容器时，把试剂瓶上贴有标签的一面我在手心，另一只手将容器倾斜，使瓶口与容器口相接触，逐渐倾斜试剂瓶，倒出试剂。试剂应沿着容器壁流入容器，或者沿着洁净的玻璃棒将液体试剂引流到细口或者平底容器内，取出所需要的剂量，逐渐竖起试剂瓶，以免液体试剂沿着试剂瓶外壁馏出。 4、若实验中有规定剂量，根据要求选用量倚、滴定管或移液管。取多的试剂不能倒回原瓶中，更不能随意丢弃，应倒入指-定的容器。 5、取用有-毒试剂，需要在老师的指导下进行或者严格按照规章取用查看更多

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微生物菌种功效解析了解下? 各种菌种对作物的影响一、枯草芽孢杆菌：增加作物抗逆性、固氮。二、巨大芽孢杆菌：解磷（磷细菌），具有很好的降解土壤中有机磷的功效。三、胶冻样芽孢杆菌：解钾，释放出可溶磷钾元素及钙、硫、镁、铁、锌、钼、锰等中微量元素。四、地衣芽孢杆菌：抗病、杀灭有害菌，五、苏云金芽孢杆菌：杀虫（包括根结线虫），对鳞翅目等节肢动物有特异性的毒杀活性。六、侧孢芽孢杆菌：促根、杀菌及降解重金属，七、胶质芽孢杆菌：有溶磷、释钾和固氮功能，分泌多种酶，增强作物对一些病害的抵抗力。八、泾阳链霉菌：具有增强土壤肥力、刺激作物生长的能力。九、菌根真菌：扩大根系吸收面，增加对原根毛吸收范围外的元素（特别是磷）的吸收能力。十、棕色固氮菌：固定空气中的游离氮，增产。十一、光合菌群：是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。十二、凝结芽孢杆菌：可降低环境中的氨-气、硫-化氢等有害气体。提高果实中氨基酸的含量。十三、米曲霉：使秸秆中的有机质成为植物生长所需的营养，提高土壤有机质，改善土壤结构。十四、淡紫拟青霉：对多种线虫都有防治效能，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。三种以上多种复合菌相互促进、相互补充，抗土传病害效果远远大于单一菌种。有益菌群相互协同，共同作用，能使作物达到高产丰产的效果 1、促进快速生长：菌群中的巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等有益微生物在代谢过程中产生大量的植物内源酶，可明显提高作物对氮、磷、钾等营养元素的吸收率。 2、调节生命活动，增产增收：菌群中的胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等有益菌可促进作物根系生长，须根增多。有益微生物菌群代谢产生的植物内源酶和植物生长调节剂经由根系进入植物体内，促进叶片光合作用，调节营养元素往果实流动，膨果增产效果明显。与施用化肥相比，在等价投入的情况下可增产15%—30%。 3、果实品质明显提高：菌群中的侧孢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等可降低植物体内硝酸盐含量20%以上，能降低重金属含量，可使果实中Vc含量提高30%以上，可溶性糖提高2—4度。乳酸菌、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等可提高果实中必需氨基酸（赖氨酸和蛋氨酸）、维生素B族和不饱和脂肪酸等的含量。果实口感好，耐储藏，卖价高。 4、分解有机物质和毒素，防止重茬：菌群中的米曲菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等有益微生物能加速有机物质的分解，为作物制造速效养分、提供动力，能分解连作有毒有害物质，防止重茬。 5、增强抗逆性：菌群中的地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌等有益微生物可增强土壤缓冲能力，保水保湿，增强作物抗旱、抗寒、抗涝能力；同时侧孢芽孢杆菌还可强化叶片保护膜，抵抗病原菌侵染，抗病，抗虫。查看更多

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实验室无菌室管理制度? 1.目的规范无菌室的使用管理，保持无菌室的卫生环境，保证微生物检测结果的准确性。 2.适用范围适用于实验室无菌室的使用和管理。 3.职责 3.1实验室检验员负责无菌室的日常使用、维护。 3.2实验室领班负责无菌室的管理。 3.3部长负责对无菌室管理情况进行监督检查。 4.内容及要求 4.1准备工作 4.1.1 无菌室的准备 4.1.1.1 无菌室应设有无菌操作间、缓冲间和更衣室，无菌操作间洁净度应达到10000级，室内温度保持在20-24℃，湿度保持在45-60%。超净台洁净度应达到100级。 4.1.1.2 无菌室经常保持清洁，每次使用前用紫外灯照射或臭氧消毒30分钟以上方可使用，并且同时打开超净台进行吹风。 4.1.1.3 无菌室应备有工作浓度的消毒液，如75%酒精、0.1%的新洁尔灭溶液等。 4.1.1.4 无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。 4.1.1.5 无菌室要求最大限度保持无菌状态，禁止在无菌室以内从事与微生物检测操作无关的活动。 4.1.2 着装准备 4.1.2.1无菌室用工作服、帽、鞋、口-罩用前必须经过紫外灯或臭氧消毒，无菌室的工作服应经常清洗，保持整洁。 4.1.2.2进入无菌室要穿专-用无菌工作服、帽、鞋、口-罩，不准将无菌室的工作服、鞋、帽穿出室外。 4.1.3操作人员准备操作人员在进行无菌操作前，双手必须进行洗手消毒（75%酒精、0.1%新洁尔灭溶液等）。非操作人员严禁进入无菌室。 4.2 操作要求 4.2.1 需要带入无菌室使用的仪器、器械、平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。 4.2.2 待检样品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。4.2.3 进入无菌室后，随手关好门，操作过程中严禁人员出入。 4.2.4 无菌操作应在超净台上进行，每次操作过程中，均应做空白对照试验样，以检查无菌操作的可靠性。检测过程严格按照检测规程进行，确保检测结果准确无误。 4.2.5 仪器、器械、平皿等物品需从传递窗口传入无菌室。 4.2.6 如有菌液或样品洒在超净台上，应立即用75%的酒精棉球擦拭干净，在消毒处理。 4.2.7 灭菌后物品放在指-定位置，注明灭菌日期，高压灭菌物品可存放3天，过期不能再用，需重新包装灭菌。 4.3 清洗要求 4.3.1 带有菌液的吸管、试管、培养皿等器皿应浸泡在盛有0.1%新洁尔灭溶液或其它消毒溶液的消毒桶内消毒。 4.3.2 凡带有活菌的物品，必须经消毒后，才能在水龙头下冲洗，严禁污染下水道。 4.3.3 操作完毕，台内物品全部取出并用消毒液喷洒消毒，用后的物品归位，垃圾带出无菌室，再用紫外灯辐照20分钟。 4.4无菌室的清洁消毒 4.4.1 无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求。 4.4.2 无菌室应每月检查菌落数。在超净工作台开启的状态下，取无菌培养皿分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露15分钟后，倒置于36℃培养箱培养48小时，取出检查。100级超净台平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级无菌操作间平均不得超过3个菌落。如超过限度，应对无菌室进行彻底消毒，直至重复检查合乎要求为止。 4.4.3 除每日进行清洁和使用前的杀菌之外，要根据空白样的检测情况，及时对无菌室进行彻底的熏蒸或消毒。查看更多

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动植物

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如何鉴定植物细胞的死活? 【实验目的】学习用质壁分离法和用活体染色法鉴定细胞死活【实验原理】活细胞与死细胞在性质上有许多差别，特别是通透性的变化最为明显。活细胞的原生质具有选择透过性；而死细胞则为全透性。选择透过性是质壁分离的先决条件。因此能发生质壁分离的细胞就表示是活的，不能发生质壁分离的细胞则说明是死的。死活细胞间不仅通透性不同，而 pH 值等情况也不同，它们对某些染料的反应明显不同。某些染料能在活细胞的细胞液中积累，但不能染活的原生质；另一方面，这些染料可使死细胞的原生质染色，但不积累于液泡。所以可根据某些染料活体染色的情况来鉴定细胞死活。【实验材料和用具】洋葱及其它植物材料、酒精灯、显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、 1M 蔗糖、 0.01% 中性红溶液等。【实验步骤】 1 、用质壁分离的方法鉴定细胞的死活。撕洋葱表皮细胞滴加 IM 蔗糖中，在显微镜下观察。细胞很快发生质壁分离，这就是细胞活着的证据。另把制取的同样制片，用冷冻、加热、干燥、酒精浸泡等方法将它们的细胞杀死，然后取代上述活材料，做质壁分离实验，结果看到已死的细胞不能发生质壁分离现象。用尿素、硝酸钾、氯化钙溶液等来代替蔗糖，能快速鉴定细胞的死活。 2 、用活体染色的方法的鉴定细胞的死活。取洋葱或其它材料，用镊子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用锋利的刀片轻轻刮去多余部分），或用刀片做成切片若干，将表皮或切片浸入中性红溶液中，放置 5-10 分钟最出用清水浸洗后置于载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察。活细胞一般在液泡内染成红色至紫色，原生质不染色，死细胞常呈橙红色，原生质和细胞核被染色。撕破的细胞，只剩细胞壁时，呈淡红色或淡紫色。为进一步鉴别细胞的死活，可把玻片上的水溶液吸去，滴一滴 1M 蔗糖溶液，便可观察到活细胞能发生质壁分离，死细胞及空细胞都有没有这种现象。可用加热、冷冻或其它方法杀死植物组织，然后用上面所述方法进行处理，比较与活组织有何不同。查看更多

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说・吧

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细胞培养室的设置、设备和准备工作? 一、细胞培养实验室的设置及设备（一）细胞培养实验室的设置组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区（1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，蕞好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。无菌操作间的空气消毒：紫外线灯—－产生臭氧，并且室内温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。空气过滤的恒温恒湿装置—－蕞好。表1 洁净室（区）空气洁净度级别表洁净度级别尘粒蕞大允许数／立方米微生物蕞大允许数浮游菌／立方米沉降菌／皿 100级 3,500 0 5 1 10000级 350,000 2,000 100 3 100000级 3,500,000 20,000 500 10 300000级 10,350,000 60,000 - 15 无臭氧紫外线消毒器电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的内外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。（2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式 b)外流式或称水平层流式。净化工作台工作原理（大致相同）—－通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。侧流式工作台—－空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌。工作台结构为封闭式。外流式（水平式）工作台—－净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，但进行有害物质实验操作则对操作者不利。工作台结构为开放式（已少用）。净化工作台应用注意：（1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。（2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。（3）使用净化工作台前，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射30～50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。（4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。（5）注意净化区内气流的变化，一旦感到气流变弱，如酒精灯火焰不动，加大电机电压仍未见情况改变则说明滤器已被阻塞，应及时更换。一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高过滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。粗过滤器中的过滤布（无纺布）应定期清洗更换，时间应根据工作环境洁净程度而定，通常间隔3-6个月进行一次。（6）净化工作台使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。（7）净化工作台应定期进行功能测试，检查净化工作台各项工作指标是否达到要求，例如进行无菌试验，定期检查台面空气的洁净度是否达标。超净工作台的无菌程度检查超净工作台在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm平皿，在超净工作台内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将平皿半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30～35℃预培养48小时，证明无菌后将平板3个，以无菌方式带入超净工作台内左、中、右各放一个；打开平皿盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将平皿盖盖好，置30～35℃培养48小时，取出检查，100级清洁度要求：3个平皿上生长的菌落数平均不得超过1个。超净工作台应定期请有关部门检查其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径≤5祄的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75~1.0m3/s；细菌菌落数平均 2．孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。 3．制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。 4．储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。 5．清洗和消毒灭菌区清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。查看更多

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微生物

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革兰氏染色法基本原理? 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-dian复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-dian复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，dian（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。医学教.育网搜集整理复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。查看更多

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什么是细胞壁？分为几层? 细胞壁(cell wall)，细胞外围的厚壁。是植物细胞特有的结构，具有保护和支持作用，并与植物细胞的吸收，蒸腾和物质的运输有关。细胞壁之厚薄常因组织、功能不同而异。植物、真菌、藻类和原核生物都具有细胞壁，而动物细胞不具有细胞壁。细胞壁分为3层，即胞间层（中层）、初生壁和次生壁。胞间层把相邻细胞粘在一起形成组织。初生壁在胞间层两侧，所有植物细胞都有。次生壁在初生壁的里面，又分为外(S1)、中(S2)、内(S3)3层，在内层里面，有时还可出现一层。这样的厚壁，水分和营养物就不能透过。有些植物的次生壁上具瘤层，还分化有特殊结构，如纹孔和瘤状物等。纹孔是细胞间物质流通的区域，而瘤状物则是次生壁里层上的突起。新细胞壁的形成是在细胞分裂末期的赤道面上，分裂的母细胞先形成成膜体。在染色体分向两极时，高尔基器分离出的小泡与微管集合在赤道面上成为细胞板。新的多糖物质沉积在细胞板上就逐渐形成胞间层。其后细胞内合成一些纤维素组成微纤丝沉积在胞间层的两侧，就出现了初生壁。当细胞成熟停止生长以后，一层层新的纤维素和半纤维素以及木质素陆续添加在初生壁上，就建成了次生壁。初生壁每添加一层，微纤维排列的方向就可不同（纵向或横向），形成了不规则的交错网状，称为多网生长。这样加厚的结果，使整个植物体的机械支持有了基础。有人认为细胞壁发生的步骤有三：①在由高尔基器所产生的小泡中形成前体（壁的结构单位），随着膜流的方向，逐步推进到细胞表面，经外排作用，放出前体；②放出的前体结合到一定的网状物上；③在稠密的细胞壁上出现化学变化，转换、变松和生长等现象，建成了细胞壁。细胞壁的化学组成：胞间层基本上是由果胶质组成，如果植物组织中的果胶质用果胶酶分解掉，细胞就会离散。初生壁是由水、半纤维素、果胶质、纤维素、蛋白质和脂类组成。胚芽鞘、茎、叶、毛等初生壁的各种成分的平均值见表。次生壁的主要成分也是半纤维素和纤维素，果胶质很少。其后木质素沉积在其上，开始不同程度的木质化。有些植物的茎、叶的表皮细胞壁分别出现有角质化、蜡质化和木栓化，其中含有角质、蜡质和木栓质，都是由脂肪酸组成的高度聚合的化合物，这些富于脂肪性物质的细胞壁，水分和气体都不能透过，可以很好地防止水分蒸腾，阻止不良气体和寄生物入侵植物体内。在禾本科植物的茎秆表皮细胞壁含有硅，也有保护作用。上述这些化学组成在生长与发育过程中是不断改变的。例如在刚出现的初生壁只有一些稀疏的微纤维附着在细胞板上，随着生长继续进行，纤维素的含量增加，而果胶质的合成则下降，次生壁在蕞幼年的形成层细胞，刚成熟的边材和在树杆中央的心材三者之间比较，果胶质含量比较恒定，但数量很少。半纤维素，纤维素和木质素的含量增加很大。如在槭树中木质素在边材中的含量比形成层细胞多90倍。查看更多

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质粒有什么作用? 质粒是很好的基因载体，被广泛用于基因工程的研究，近年来根据重组DNA技术和遗传工程的需要，大量组建了有利于基因的运载、扩增和表达的各种质粒。作为基因工程的运载体必须具备以下条件： 1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2.具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3.具有某些标记基因，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因。查看更多

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无血清培养基的优点有哪些? 无血清培养基储存方法：2-8℃避光保存，ES/iPS 的无饲养层培养基于胚胎干细胞的培养或是用于诱导的多能干细胞，其能够维持未分化的iPS / ES细胞的高扩增率，为科研研究需求提供了高水平的安全性和高扩增率。无血清培养基不得不说的优点： 1、更换培养基频率低。 2、较低的培养基体积（6孔板）。 3、在任何的培养基质下都有生长性能。 4、来自单细胞克隆的优异集落形成效率。 5、高稳定性和可重复性的单细胞和无饲养细胞培养系统。 6、可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。 7、避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。 8、避免血清组分对实验研究的影响。 9、有利于体外培养细胞的分化。 10、可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。查看更多

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