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细胞培养污染了怎么办? 污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。（一）污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。 1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。 5、非同种细胞污染由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。（二）、污染的鉴别 1、细菌、真菌污染的检测（1）肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。（3）接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。（2）镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。 2、支原体污染的检测（1）相差显微镜观察直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。（2）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。 A positive （3）电镜检测若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。查看更多

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超滤离心管想重复使用，如何清洗和保存? 使用后用0.1M NaOH泡24h，然后20%乙醇浸泡保存。查看更多

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电泳时条带跑出凝胶，是什么情况? 1、电压大，时间长，跑出去了 2、正负极接反了查看更多

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细胞及分子

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细胞密度对细胞周期有影响吗? 细胞密度过大会影响细胞周期的。最好还是把密度调整到最适密度再做比较好。查看更多

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PC12细胞培养实验步骤? PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。 1. PC12细胞有两种：未分化型和分化型。其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强，传代时需要胰酶消化，形状不规则。分化型PC12细胞传代时不需要胰酶，直接可以吹下来，形状规则。这两种细胞没有很大的区别，但我在实验中发现，未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。 2. 由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，在传代次数较多后，它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。主要是细胞形状变得更加不规则，对药物的敏感性愈加下降。因此，建议长期用PC12细胞作实验的战友zui好严格控制细胞的传代次数。 3.在复苏细胞时动作一定要迅速，放入温水中1～2min后要马上加入培养液中，培养12～24小时后更换一次培养液，这样不仅可以把DMSO吸掉，而且可以将死亡的细胞也吸掉。细胞一天一看即可，经常动会有影响。注意过滤后血清的PH值，因为培养液过滤后PH值会有所改变。复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些） 4. 状态良好的细胞复苏后 4 h即可贴壁，开始增殖，大约2 d即可传代，接种48h应该到了对数增长期。 5. 每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。 6. 传代时我认为zui好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS） 7. 传代的时机zui好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时zui好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，zui后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。 8. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。 9. 就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。查看更多

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干细胞疗法引起的怪异副作用? 由UConn Health领导的一组研究人员于7月29日在《神经病学年鉴》上报道说，未经证实的“干细胞”疗法引起的怪异副作用比我们想象的要普遍得多。耐心。遭受令人衰弱的大脑或脊髓损伤的人，或被诊断患有进行性神经系统疾病的人，常常因缺乏可帮助他们的治疗方法而感到沮丧。这种挫折感使它们成为为患者注入“干细胞”的诊所的容易目标。但是，这些诊所中的大多数都在美国食品药品监督管理局的管辖范围之外运营，并且它们提供的治疗方法未经证实。而且价格昂贵。该论文的高级作者，《综合多重研究》的负责人Jaime Imitola说：“这是一个不道德的行业。他们使用高档网站承诺向左和向右治愈，但它们绝不是什么。他们偷了钱却没有给予任何回报。” UConn Health的硬化症中心。患者通常需要支付25,000至50,000美元的现金来进行自称治愈多发性硬化症至瘫痪的各种手术，但没有证据支持。这些诊所可以在美国运营，但更常见于墨西哥，中国，俄罗斯和其他卫生法规较宽松的国家/地区，诱使患者飞出一两个星期，进行类似水疗的治疗，物理疗法和干针注射据说设计用于治疗多发性硬化症，ALS，瘫痪或患者遭受的任何其他神经系统损伤的细胞。物理疗法通常会使患者感觉好一两个星期。但是令人遗憾的是，目前还没有能够可靠地改善大多数此类疾病的疗法，而且绝对没有使用干细胞的疗法。为了更好地了解这种干细胞旅游的影响，正如业内人士所说，由UConn Health领导的一组研究人员对学术神经学家在干细胞旅游并发症中的经验进行了全国性调查。该调查还调查了为患者提供咨询和教育的医师准备水平。 Imitola与俄亥俄州立大学神经科学研究所的同事共同领导了这项研究。研究人员与任何人一样，都知道从任何一种干细胞治疗药物到这些神经系统疾病有多远。他们让患者来找他们征求许可-临床称其为“清除”-以进行干细胞注射治疗。调查结果表明，干细胞旅游带来的不良后果比任何人都意识到的要普遍得多。在接受调查的神经学家中，四分之一的患者患有干细胞治疗相关的并发症。曾有感染，中风，脊柱肿瘤，癫痫发作甚至死亡的患者的报道。73%接受调查的神经科医生表示，他们认为拥有更多与患者讨论这个问题的教育工具将有帮助。 “干细胞为患者带来了希望，不仅是绝望的患有绝症的患者，还有那些正在寻找现代医学无法使他们成功的'自然解决方案'的患者。有趣的是，我花了许多时间与患者讨论了强有力的新免疫疗法以防止多发性硬化症或视神经脊髓炎的复发;但是，当他们问这些疗法是否能帮助他们走路或再次看病时，我不得不承认他们不会。”神经免疫学和神经感染性疾病研究部门主任迈克尔·列维(Michael Levy)说。并未参与这项研究的哈佛医学院麻省总医院的人。列维说，伊米托拉和他的同事的论文发现，许多神经科医生都面临着这些问题，但是大多数没有干细胞疗法的经验。查看更多

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免疫组化方法中关键环节及其原理解述? 一、酶免疫组化的关键环节 1、标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。 2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。 3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。 4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。 5、细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（ 10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。 6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。 7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。 8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 9、抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在geng换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。 10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解） 11、DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。 12、复染：目的是形成细胞轮廓，从而geng好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。 13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。二、免疫荧光方法中的重要环节 1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。 2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。 3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。 4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。 6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而geng好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。 7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解） 9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。查看更多

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菌落PCR（Colony PCR）方法? 菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。具体方法： 1、PCR混合物的制备 Taq buffer（10×） 20 ul dNTP（2.5 mM） 5 ul Primer Forward（50 mM） 10 ul Primer Reverse（50 mM） 10 ul ddH 2O 147 ul Taq（2U/ul） 8 ul total 200 ul 将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。 2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。 3、将混有菌体的PCR混合物置于 PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。 4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。查看更多

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转染和转化的区别? 转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA （质粒和线性双链DNA ），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。转化特指将质粒DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。由外来DNA 引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA 注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。载体:能在连接酶的作用下和外源DNA 片段连接并运送DNA 分子进入受体细胞的DNA 分子。转化:指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA 分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA 的过程。转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。查看更多

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冻存的细胞该如何开始培养? ⑴将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。 ⑵用10秒钟时间将小管的盖子拧松1/4以去除残留在螺纹处的液氮，然后将盖子盖紧。 ⑶将小管放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。 ⑷将小管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。 ⑸用70％的酒精冲洗小管，然后擦去多余酒精。 ⑹打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹。用1ml离心管离心内容物。 ⑺平衡管内物，用多聚赖氨酸包被培养瓶(多数细胞用T-75的培养瓶)。多数细胞类型推荐接种密度为每平方厘米5000细胞。 ⑻盖好盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。 ⑼将培养瓶放放培养箱中(37℃,5%CO2,95%空气) ⑽植入培养后第6-16小时更换一次培养基以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。生物试剂的使用常识：（1）试剂切忌与手接触（有些试剂有强腐蚀性、等特性）。（2）要用洁净的药勺，量筒或滴管取用试剂，绝对不允许用同一种工具同时连续取用多种试剂。取完一种试剂后，应将工具洗净（药勺要擦干）后，才可取用另一种试剂。（3）试剂取用后一定要将瓶塞盖紧，不可放错瓶盖和滴管，绝不允许张冠李戴，用完后请及时将瓶放回原处，以免遗忘，带来不便。（4）已取出的试剂不能再放回原试剂瓶内（怕产生原试剂的再次污染）。处理提示： 1、购买后，请务必确认标签上的注意事项。 2、做好预防颠倒，摔坏的措施和管理体制。 3、在使用前再次确认标签上的注意事项。做好必要的安全对策。 4、对没有标明其危险特性，有害特性的，也要慎重地进行操作。 5、必须戴好防护用具，小心翼翼进行操作。 6、请参照相关法规，文献，MSDS等信息，理解并掌握好试剂的特性，再进行安全操作。 7、通常购买试剂时要想到一次性用完。若估算不足有剩余的话，要更加注意其保管和管理。 8、万一试剂操作者并非专业技术人员。必须在专业人士的指导监督下进行操作。 9、对于使用后的废弃物，不要或旧的试剂，应按照相关法律法规正当处理。查看更多

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乱入的RNA 不能停下的“舞步”? 大脑中错放的RNA，会破坏神经元，让人们无法控制行动，甚至出现亨廷顿舞蹈病。美国麻省理工学院的神经科学家发现，亨廷顿舞蹈病患者神经元死亡的重要原因，可能是对线粒体非正常释放的遗传物质的免疫反应。线粒体是提供能量的细胞成分。这项研究全面跟踪了不同类型的脑细胞，如何应对导致亨廷顿舞蹈病的突变。研究人员测量了在疾病发展不同阶段的不同细胞类型中，亨廷顿舞蹈病死亡患者的大脑样本与正常人的RNA差异，以及经过不同程度基因突变改造的小鼠的RNA水平。 “线粒体释放的这些RNA看上去就像病毒RNA，这引发了先天免疫，并可能导致细胞死亡。”该研究通讯作者、美国麻省理工学院大脑与认知科学系副教授Myriam Heiman说，“我们相信这是触发炎症信号通路的一部分。” 危害从发育开始亨廷顿舞蹈病是一种染色体显性遗传所导致的脑部退化疾病，能无情地夺走受害者对运动和思想的控制能力。患者会出现颤搐等舞蹈症状，最终可能过早死亡。在全球范围内，每10万人中有3到10人受该疾病影响，目前没有治疗方法。该疾病是以美国内科医生乔治·亨廷顿的名字命名的，他在1872年描述了这种疾病。100多年来，科学家一直在探索这种疾病。1993年，科学家发现引起亨廷顿舞蹈病的基因突变位于4号染色体短臂的顶端附近。但没有人知道突变亨廷顿蛋白（mHTT）是如何破坏神经元的。甚至亨廷顿舞蹈病是一种晚期表现的神经退行性疾病，但小鼠研究和症状前突变携带者的神经影像学研究均表明，亨廷顿舞蹈病可能会影响神经发育。 7月16日刊登于《科学》的这项研究指出，人类胎儿（妊娠13周）携带亨廷顿舞蹈病突变的组织，在发育皮质中显示出明显的异常，包括突变的亨廷顿蛋白和连接复合蛋白的定位错误、神经祖细胞极性和分化的缺陷、异常的纤毛发生以及有丝分裂和细胞周期进程的改变。因此研究人员表示，亨廷顿舞蹈病对神经发育有影响，而不仅仅是一种退行性疾病。但是，“由于突变蛋白的功能和引起疾病的相关机制仍然未知，因此无法利用传统方法针对其病理功能筛选阻断剂。”复旦大学医学神经生物学国家重点实验室研究员鲁伯埙表示。线粒体“事故” 为了geng好地探究亨廷顿舞蹈病的秘密，Heiman研究组采用了两种不同的筛选技术，TRAP能用于小鼠模型，而单核RNA测序可用于小鼠和人。结果令人惊讶的发现是，线粒体中的RNA被错放在了被称为刺突投射神经元（SPN）的脑细胞中，从而破坏了这些神经元，导致了致命的神经症状。研究人员观察到，这些游离的RNA在细胞中看起来与从细胞核中提取的RNA不同，引发了有问题的免疫反应。而且，他们不仅发现了线粒体RNA 的存在，而且还显示了氧化磷酸化过程的基因表达缺失，氧化磷酸化过程是需要燃料的神经元产生能量的过程。之前，小鼠实验表明，这种氧化磷酸化的下调和线粒体RNA释放的增加，都发生在亨廷顿舞蹈病的早期，在大多数其他基因表达差异显现之前。此外，研究人员还发现一种被称为PKR的免疫系统蛋白表达增加，该蛋白被证明是释放线粒体RNA的传感器。事实上，研究小组发现，PKR不仅在神经元中升高，而且被激活并与线粒体RNA结合。 Heiman说，新发现似乎与一些临床症状相一致。例如，亨廷顿舞蹈病会导致大脑纹状体区域的损伤；在Aicardi-Goutières 综合征中，由于先天免疫反应失调，同样的大脑区域可能会受损；患有硫胺素缺乏症的儿童会出现线粒体功能障碍，研究表明其小鼠模型也表现出PKR激活。 “该论文最大的亮点是组学部分，应该是第一篇用单细胞（单核）测序以及TRAP（测量正在被翻译的mRNA）的组学研究。” 对临床可能有借鉴 Heiman表示，他们还发现了基因表达上的重大差异，包括与重要神经功能有关的差异，如突触回路连接和生物钟功能。此外，该团队发现神经元中这些基因转录改变的主要调节因子可能是视黄酸受体b转录因子。“这可能是一个对临床有用的发现，因为有药物可以激活Rarb。”Heiman告诉《中国科学报》，“如果能够抑制转录失调，我们就能够改变疾病的结果。但这是一个需要验证的重要假设。” 另一方面，研究人员在人脑样本神经元中看到的许多基因表达差异，与他们在小鼠神经元中看到的变化非常吻合，这进一步保证了小鼠模型对研究这种疾病有用。这个问题一直困扰着这个领域，因为小鼠通常不会像人那样出现那么多的神经元死亡。 “我们看到的是，实际上小鼠模型很好地再现了发生在人类亨廷顿舞蹈病期神经元的基因表达变化。但其他一些非神经元的细胞类型在人类疾病和小鼠模型之间并没有表现出那么多的保守性，我们相信这些信息将有助于其他研究者开展未来研究。”Heiman说。实际上，除了小鼠模型，猪也在为该领域研究“出力”。2018年，研究人员首次利用基因编辑技术CRISPR-Cas9和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪，能精准地模拟出人类神经退行性疾病。此外，2019年鲁伯埙团队开创性地提出基于自噬小体绑定化合物的药物研发原创概念，并巧妙地通过基于化合物芯片和前沿光学方法的筛选，发现了特异性降低亨廷顿舞蹈病致病蛋白的小分子化合物，有望为临床治疗带来新曙光。查看更多

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血球计数板细胞计数法你会吗? 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。一、步骤 1、制备细胞悬液：对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物按如下步骤制备成细胞悬液。 1）、终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。 2）、给培养瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化3～5min 。期间不断在镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。 3）、加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。 2、计数与计算过程 1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。 2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。 3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。 4）、按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml 。二、注意事项： 1）、务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。 2）、显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团 10％，说明细胞分散不充分。查看更多

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实验室微生物样品收集与保存攻略？！？如何在无缺失或多样性改变的前提下保存实验室中的微生物样品过去十年间，科学家们花费数十亿美元完成了人体、土壤和海洋等不同地点的微生物的分类归总，通过日益精确的新一代测序技术，我们对这些差别甚大的微生物有了更多的认识，比如说，对细菌核糖体小亚基 16S rRNA 编码基因进行高通量测序，科学家们能了解样品中的微生物多样性。此外还可以选择鸟枪宏基因组学作为互补技术，分析样品中所有生物的所有基因。这些DNA测序技术十分敏感，也能识别样品污染和危害样品处理引发的细微变化。由于处理和存储样品的变化会影响研究结果，因此要想维持在现场收集样品的完整性也是微生物研究中的一项重大挑战。来自Mayo医院的微生物生态学家 Vanessa Hale表示，金标准方法是从新鲜样本中立即提取DNA 或 RNA。当不可能立即处理的时候，最好能将样品储存在?80°C。室温下粪便样品中的微生物组成会在一到两天内发生转变，其它样品，如土壤也同样具有温度敏感性。但是超低温冰箱并不是随取随到的，也许粪便样本首先在家里收集得到，或者研究人员需要从很远的地方收集土壤样品。在一些情况下，样品都需要存储和保留几天或几周，才能进行DNA和 RNA的提取和分析。来自芝加哥大学的微生物生态学家 Jack Gilbert说，“微生物多样化多到可怕，而且复杂。任何特殊处理都会改变其组成部分。”不过随着技术发展，现在可以进行更多深入的微生物群落分析，即使是微生物菌群最小的变化或者相对丰度改变，也会极大的干扰群体比对，因此储存方法引起的变化越小越好。以下是The Scientist杂志推荐的一些样品保存技巧。样品均质化原始样品的保真性从收集样品的那一刻就开始了。第一步需要确保你获得的是一个均匀的样品，“如果一个样品不是均质样品，那么首先要使之均质化，”来自比利时根特大学的微生物学家Kim Heylen说，“如果你想要重复性好的样品，那么（这样做）至关重要。” 美国加州大学戴维斯分校的微生物学家Holly Ganz在一家非盈利机构KittyBiome进行野猫和家猫的微生物组研究，他们一般采集野猫和家猫的粪便作为样品，她说，“粪便当然不是均质的，因此这就产生了一个问题：采用哪一部分的粪便会影响研究结果。” 因此Ganz需要均质化样品，她首先去除了粪便的外层，这一部分可能包含有环境污染物，然后剩余部分放置到塑料袋中进行人工碾磨和混合。之后Ganz又将样品铺开，收集二次样品，“要让粪便样品均质化并不容易，所以我只好增加二次取样的次数，”她说。 2015年，一组研究人员完成了一项人肠道微生物组的研究，他们将液氮粪便样品通过研钵及研杵捣碎，使之成为粉末状小样品，然后转移到试管中，?80°C储存。比较于之前的方法，这种制备样品的方法能减少微生物组成上出现的可变性。查看更多

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我们距新一代干细胞疗法还有多远? 生命的奥秘在于一个受精卵如何发育成复杂的生物体。这个过程中，能够无限增殖和分化的干细胞扮演着极其重要的角色，可以说，干细胞是人类生命的起源。60余年来，科学家们对干细胞的研究从未停步。这个领域的研究成果，曾位列《时代周刊》“20世纪末世界十大科技成就”之首，也曾在2012年摘得诺贝尔生理学或医学奖的桂冠。时至今日，干细胞疗法依然备受关注，新锐公司层出不穷，大型医药公司如拜耳（Bayer）、诺和诺德（Novo Nordisk）、武田（Takeda）等也纷纷涉足这一技术的开发和临床应用。今日，我们将带领读者了解干细胞及其背后的疗法究竟有多大的潜力。 60余年过去，新一代疗法已兴起干细胞（stem cell）的发现可以追溯至上世纪60年代。这是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。这种特点为它在医学领域的应用打开了广阔的前景。随着人类的不断研究和探索，在全球范围内，除了干细胞移植，已有十余款第一代干细胞治疗产品被批准应用于临床。比如，FCB-Pharmicell公司的HeartiCellgram-AMI，于2011年在韩国被批准用于治疗急性心肌梗死；Osiris公司开发的Prochymal，于2012年在加拿大被批准用于治疗儿童移植物抗宿主病（GVHD）。根据《自然》杂志子刊Nature reviews drug discovery今年5月刊登的一篇综述，目前基于基因和细胞改造的新一代干细胞疗法正在兴起。这些疗法有望提高干细胞疗法的有效性和特异性，并能够将治疗的疾病范围扩大至更广泛的领域。三大应用前景目前，干细胞用于疾病治疗的应用前景主要包括以下几个方面：一是用于开发细胞疗法。其中，造血干细胞移植（又称骨髓移植）是目前最为成熟的干细胞疗法之一，它通过静脉输注造血干、祖细胞，重建患者正常造血与免疫系统。目前，该疗法已在多个国家被批准用于治疗白血病等恶性血液性疾病。在最新开发的干细胞疗法中，利用诱导性多能干细胞（ipsC）开发“通用型”细胞疗法的做法受到广泛关注。这类疗法可以将干细胞诱导分化成特定组织细胞，治疗的疾病范围非常广泛，比如炎症、自身免疫疾病、心衰、脑卒中等。目前，拜耳、武田等公司均在推动这类产品的临床开发。另外，通过设计可以将干细胞用于组织修复、遗传类疾病等。二是作为基因治疗的载体。比如由Orchard公司开发的造血干细胞基因疗法OTL-101，它从患者体内分离出造血干细胞，通过慢病毒载体引入表达腺苷脱氨酶的ADA基因，然后将其回输至患者体内。该疗法在治疗腺苷脱氨酶缺乏症导致的严重联合免疫缺陷患者的注册性试验已取得积极结果，20例受试者在接受治疗的两年之后仍然维持100%的总生存率。三是用于组织/器官替代治疗。这是再生医学的范畴，简单来说，就是利用干细胞技术将人体“不健康”的部位重新替换。目前，这一领域已经在早期研究中也取得了重要进展。比如，利用干细胞再生心肌，有望帮助修复受伤的心脏；用于制造人类皮肤，有望为那些受脱发、疤痕或遗传性皮肤病之苦的人带来革命性的治疗；它甚至还有促进脑组织再生的潜力，有望帮助缺血性卒中或脑震荡等脑损伤患者恢复有关功能。值得注意的是，除了干细胞移植外，目前正在中国开发的干细胞疗法，均属于临床试验的范畴。查看更多

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小学生研究基因获全国大奖引质疑，神童真的存在吗? 7月12日，一则云南省昆明市盘龙小学六年级学生陈某石通过研究突变基因“在结直肠癌发生发展中的功能与机制”，获得全国青少年科技创新大奖的信息，在社交媒体中广为传播。有网友指出，这样的科研水平，远远超出一个小学六年级学生的认知范围，“背后肯定存在严重的学术腐败，呼吁严查。” 7月13日，云南省科协相关负责人对表示，已经注意到舆论对于陈同学基因研究的关注。小学生研究基因获全国科技创新大奖记者核实发现，在全国青少年科技创新大赛官网在线展示栏目中，展示了来自云南代表队生命科学类的小学组参赛项目《C10orf67在结直肠癌发生发展中的功能与机制研究》，项目作者是来自昆明市盘龙区盘龙小学六年级的陈某石。官网显示，该研究项目获得了2019年第34届全国青少年科技创新大赛三等奖。《C10orf67在结直肠癌发生发展中的功能与机制研究》项目简介介绍，“本项目前期利用遗传学比较分析了高原家养哺乳动物和对应平原物种的基因组和转录组，发现了高原哺乳动物低氧适应受选择的关键突变基因C10orf67，并构建了C10orf67基因敲除小鼠”，并称通过细胞生物学、生物化学等方面，对C10orf67在结直肠癌发生发展中的作用进行解析，发现C10orf67在结直肠癌中高表达，敲低其表达可以显著抑制细胞的增殖，将细胞阻滞在G2/M期，“进一步的研究表明，C10orf67可以调节结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性”。小学六年级的陈同学认为，这有望为结直肠癌的诊断和治疗提供新的生物标志物和药物靶点。记者注意到，在陈同学的研究成果展示页面，还公布了相关实验记录。相关实验记录显示，2018年1月6日，陈同学在指导教师、盘龙小区教师吕冬梅的带领下，在中国科学院昆明动物研究所与“陈老师和杨老师商量开展参与研究工作”。同年1月9日，陈同学表示老师们给了他“一个基因”，随后陈同学“上网搜了一下什么叫基因”。在实验记录上，陈同学手写了“基因(遗传因子)是具有遗传效应的DNA片段”的笔记。1月10日实验记录中，陈同学表现出了困惑，直言“还是不太了解基因”，但在老师的帮助下明白了“基因要翻译成蛋白后才能发挥作用”的道理。到了2018年1月13日，陈同学就表示了解了PCR技术的原理，知道了PCR引物的设计等，了解了为何通过荧光强弱就可以知道哪些基因的RNA表达水平。评论称参赛项目科研水平与博士相当陈同学的相关研究成果在网络上曝光之后，引发众多网友质疑。网友们认为，作为一个小学生，根本不可能有相应的知识储备用于研究生物科学的相关课题。一所985大学在读博士生李玲对记者表示，根据陈同学的实验记录，刚开始他连基因是什么都不清楚，“连基因是什么都不知道的小朋友，怎么可能明白基因片段和癌症直接的关系?” 在水木社区论坛里，网友跟帖评论，“牛，直接进中科院读博士吧。这得从小在实验室做实验，听报告长大的。关键是要有狂热的兴趣才能实现。”“这一看就是父母研究这一块的啊，这篇大概是个医学硕士生的水平了。” 知名医疗媒体账号“丁香园”评论说，“纵观整个获奖项目，不论是项目的立意，还是后期具体的实验设计，都和一个硕士、甚至博士研究生的科研水平一般无二。” 记者查询发现，陈同学关于《C10orf67在结直肠癌发生发展中的功能与机制研究》课题在获得全国青少年创新大赛三等奖之前，还代表盘龙小学获得了第34届云南省青少年科技创新大赛暨机器人竞赛的科技创新成果一等奖，指导老师是吕冬梅。获奖学生父母被指是中科院研究员网络上有传言称，陈同学的父母是中国科学院昆明动物研究所肿瘤信号转导学科组的两位研究员，陈同学正是在父母的帮助下完成了课题研究。有科研人员发文表示，期刊《National Science Review》2019年发表了一份研究成果，来自中科院昆明动物所的研究人员比较分析了多个家养动物适应青藏高原遗传机制的个性和共性特征，鉴定出一个新的低氧通路基因C10orf67。根据这篇论文的介绍，C10orf67是一个受到正选择的与低氧耐受相关的基因，可以减少细胞在缺氧条件下的凋亡率，并认为C10orf67或许会在肿瘤的发生发展中起到潜在作用。值得注意的是，相关论文的作者，正是被指为陈同学父母的两位中科院昆明动物研究所研究员。 7月13日，记者多次拨打被指为陈同学父母的中科院昆明动物研究所两位研究员的办公电话，但始终无人接听，相关采访邮件截止发稿时也未收到回复。 7月13日，记者联系了全国青少年创新大赛组委会，对方表示对于相关情况应联系云南赛区组委会。云南赛区组委会则称，接受采访的权限在云南省科协。云南省科协负责青少年创新大赛的相关人士表示，他们已经注意到了相关的舆论讨论，但目前没有进一步的说明，“去年比赛时陈同学的答辩通过了，云南这边就把他的项目推荐到了全国赛。” 对于公众关心的相关比赛中是否存在学术造假等问题，云南省科协相关人士没有正面回复。最新消息：7月13日，中科院昆明动物研究所通报称，经初步核查，该获奖项目学生系中科院昆明动物研究所研究员之子。针对此事，中科院昆明动物研究所高度重视，已成立调查组进行深入调查，后续将及时向社会反馈相关调查结果。查看更多

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研究揭秘植物 “抵抗” 病原菌过程? 6 月 15 日，《自然—植物》在线发表了华中农业大学教授 Kenichi Tsuda 团队的最新研究成果。研究人员利用植物体内原位细菌转录组及蛋白质组学技术，建立了病原细菌基因调控网络，报道了被寄主免疫系统攻击的病原细菌主要调控途径。细菌致病因子的表达和植物免疫成分的变化形成了植物与微生物相互作用过程中的复杂关系。该关系的研究对全面理解细菌如何引起植物病害以及植物如何保护自己免受病原菌侵染至关重要。为了研究感染期间细菌基因的表达模式，研究人员选取了模式细菌丁香假单胞菌和拟南芥作为研究材料。通过对丁香假单胞菌的信使核糖核酸（mRNA）及蛋白质的分析，作者发现病原菌在宿主侵染过程中的核糖核酸（RNA）及蛋白表达与体外培养相比，存在较大差异，尤其是在植物与病原菌互作早期，说明这些早期基因表达模式的变化对侵染植物过程至关重要。同时，为了解植物免疫对细菌基因表达的影响，研究人员选取了与植物免疫过程相关的拟南芥突变植株。对细菌转录及蛋白在不同突变体植株中变化的分析表明，受水杨酸（SA）调控的植物免疫参与了对细菌致病相关 mRNA 和蛋白质的抑制过程。值得一提的是，SA 介导的植物免疫能够特异地抑制介导病原菌毒性蛋白进入宿主体内的三型分泌系统尖端组分蛋白的累积。通过对 4765 个基因的表达进行相互关联及聚类分析，研究人员鉴定出许多功能未知的基因簇能够参与细菌生长过程，同时成功预测出先前未知的转录调控因子，并进一步验证了这些转录因子确实参与了相关基因的表达调控和与病原菌的致病性。此研究为分析植物与病原细菌互作的过程中，细菌遗传信息如何转化为功能蛋白提供了证据，有助于深入了解植物免疫抑制病原菌侵染的分子机制。查看更多

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血液标本抗凝剂该如何选择呢? 1.乙二胺四乙酸(EDTA)盐常用有钠盐或钾盐。 ①抗凝原理：螯合钙离子。 ②使用方法：量为1.5～2.2mg/ml血液。 ③适用范围：对血细胞形态、血小板计数影响很小。根据国-际血液学标准化委员会(ICSH)建议，CBC抗凝剂用EDTA-K2。不适于凝血检查、血小板功能试验。 2.草酸盐 ①抗凝原理：草酸钙沉淀。 ②适用范围　双草酸盐血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等检查。不适于血小板计数、白细胞分类计数。 3.肝素 ①抗凝原理：加强抗凝血酶(AT)灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。 ②使用方法：每毫升血液肝素用量为(15±2.5)U，多为肝素钠盐或钾盐。 ③适用范围：红细胞渗透脆性试验。不适于CBC、细胞形态学检查。 4.枸橼酸盐 ①抗凝原理：能与血液中钙离子结合形成螯合物。 ②使用方法：配成109mmol/L的浓度。 1:9------凝血 1:4------红细胞沉降率 ③适用范围：凝血检查、红细胞沉降率、输血保养液。查看更多

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0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法? PBS缓冲液是大家做ELISA实验室必须用到的，其配置各有自己的方法，希望下面的方法对大家有些帮助！称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4℃冰箱中。需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。如果是用于免疫组化的话，则需要在配置的时候分别加入100 u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。 NaCl 8.0g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.44g ； KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水至 1000ml，调节pH 到 7.4（用Na2HPO4或KH2PO4调节）。用于免疫反应时可加入 0.1%叠氮钠（0.1g/100ml PBS）;当试剂中含有辣根过氧化物酶时，严禁使用叠氮钠，可改用0.01%柳硫汞。 PBS缓冲液配方 PH 7.6 7.4 7.2 7.0 H2O 1000 1000 1000 1000 NaCl 8.5 8.5 8.5 8.5 Na2HPO4 2.2 2.2 2.2 2.2 NaH2PO4 0.1 0.2 0.3 0.4 根据经验来看，新鲜配置的PBS搅匀后其PH值约在7.2-7.4之间，可是在温度的影响下，尤其在夏天，其电离常数发生了改变，在经过昼夜的时间后，PH值会明显改变（我亲自测过偏酸）。所以做实验的同学可要注意了，PH值可能会影响实验结果，甚至可能导致阴性。所以务必记得这个时候和天气，要加强实验条件控制问题。每次使用前最好用试纸测一下过夜了的PBS，如果发生偏酸或偏碱，注意重新换新液。 PBS缓冲液称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。 PBST缓冲液取300μl Tween-20 加入PBS 100ml中，混匀后即刻使用。现用现配。如果是把所有固体加大十倍，配置为浓缩液，工作时候十倍稀释，那么，在刚配好浓缩液时，PH在6.5左右，明显偏酸。不能用盐酸调。虽然可以用氢氧-化钠颗粒调，但是有更方便的方法。十倍稀释以后，PH自动升高到所需要的值。不需要其它任何处理。这个可以先取少量试一试，配好之后再测一次~ PH8.0的PBS配方详细 1. NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加浓盐酸将pH值调节至8.0，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)的配制：甲液：0.05mol/L Na2HPO4溶液：称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸馏水至1000ml ; 乙液：0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m1。将甲乙液分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表: pH 甲液ml 乙液mI 5.29 2.5 97.5 5.59 5.0 95.0 5.91 10.0 90.0 6.24 20.0 80.0 6.47 30.0 70.0 6.64 40.0 60.0 6.81 50.0 50.0 6.98 60.0 40.0 7.17 70.0 30.0 7.38 80.0 20.0 7.73 90.0 10.0 8.04 95.0 5.0 你要配制pH=6.8的PBS，可用甲、乙液各50ml混合即可。查看更多

#磷酸盐缓冲液（PBS）

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微生物

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细菌是如何形成天然产物的? 许多活性药物都来自天然产物，之所以这么叫，是因为通常只有微生物才能产生复杂的结构。类似于工厂的生产线，大型酶复合物将这些活性剂分子聚合在一起。慕尼黑理工大学（TUM）和法兰克福歌德大学（Goete University Frankfurt）的一个研究小组已经成功地剖开了其中一个分子工厂的基本机制。许多活性药物都来自天然产物，之所以这么叫，是因为通常只有微生物才能产生复杂的结构。类似于工厂的生产线，大型酶复合物将这些活性剂分子聚合在一起。慕尼黑理工大学（TUM）和法兰克福歌德大学（Goete University Frankfurt）的一个研究小组已经成功地剖开了其中一个分子工厂的基本机制。许多重要的药物，如抗生素或抗癌活性剂，都是由微生物（如细菌或真菌）合成的天然产物。在实验室里，这些天然产物往往根本无法生产出来，或者需要付出很大的努力。许多这类化合物的起始点是聚酮类化合物。在一个微生物细胞中，如发光光杆状菌（Photorhabdus luminescens），它们是通过聚酮合成酶（PKS）产生这类化合物的。在PKSⅡ型系统的第一阶段，为了逐步建立起所需的分子，四种蛋白质协同工作。在第二阶段，它们被进一步的酶修饰成所需的天然产物。以这种方式生产的细菌天然产物的例子包括临床上使用的四环素抗生素或抗癌药物阿霉素。跨学科合作虽然第二阶段的改性步骤得到了很好的研究，但到目前为止，对第一阶段的一般功能几乎没有任何见解，在这些分子工厂中，高活性聚酮中间产物与酶复合物结合并受到保护，使其不能自发反应。慕尼黑技术大学生物化学教授迈克尔?格罗尔（Michael Groll）和法兰克福歌德大学（Goete University Frankfurt）分子生物技术教授海尔格?博德（Helge Bode）两个工作组合作，现已弥合了这一差距，这些成果发表在著名的科学期刊《Nature Chemistry》上。这些发现对活性剂的新合成有启发作用 Michael解释说：“在这项工作的背景下，我们第一次能够借助X射线结构分析来分析II型聚酮合酶的不同伴侣蛋白复合物，更详细地了解了整个催化循环。” “基于这些发现，将来有可能以有针对性的方式操纵中枢生化过程，从而改变基本结构，而不是局限于修饰酶，”Helge补充道。尽管开发改良抗生素和其他药物还有很长的路要走，但两个课题组都乐观地认为，现在分子工厂缺失部分的结构和机制可以解释了。“我们已经获得了合成新蛋白质复合物的潜力数据。” 查看更多

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动植物

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动物细胞或组织的蛋白质抽提步骤? 一、培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤 1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。 2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。 3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。 4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。 5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。 6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤 1、2500xg离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液 2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞，2500xg离心10分钟沉淀细胞，去上清。 3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。 4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂） 5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。 6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤 1、组织称重，切小块放入管中。 2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。 3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。 4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。 5、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。查看更多

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