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细胞及分子

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全血细胞培养染色体技术常用试剂配制你会吗? 一、国内实验室应用试剂配制（一）培养液（1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节 pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。（2）小牛血清商品：成都生物制品厂。（3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。（4）pH调整液：5% NaHCO3溶液高压灭菌（8磅15min），0.1N稀盐酸液100ml。（5）秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌（8磅10min）。（6）磷酸缓冲液：pH7.4。磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。（7）Giemsa染色液： Giemsa粉剂　　　　　　　　　　　1g 甘油　　　　　　　　　　　　　　66ml 在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。（二）固定液（1）甲酸：冰乙酸3：1混合即用。（2）PBS缓冲液配制： NaCl　　 16g　　 Na2HPO4(12H2O) 　　5.65g KCl　　　0.4g 　KH2PO4　　　　　　　　0.4g 加双蒸水至1000ml pH7.0。取5%胰酶（生理盐水配制）1ml加入50ml PBS液中（最终浓度为0.025%），4℃冰箱待用。二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990） 1．完全培养基 RPMI　　　　　　　　　　　　 76.0ml 胎牛血清　　　　　　　　　　20.0ml 植物凝集素　　　　　　　　　 2.0ml 抗生素/抗菌素溶液（100）查看更多

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引物修饰的常见类型及应用? 脱氧次黄嘌呤（deoxyInosine，dI）：脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基但当与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC dI:dA dI:dG dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。脱氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）：脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。硫代（Phosphorothioate，S-oligos）： S-oligos是寡核苷酸中单核苷酸间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的，碱基被添加上后，再进行连接修饰。两个碱基之间的磷酸可以转换成双键"S"(用硫代试剂）代替普通的双键"O"（用碘溶液）。硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。磷酸化（Phosphorylation）： 5'磷酸化是通过B-氰乙基化学反应添加到引物5'端的糖环上，而不是最后一个碱基上。可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应；在可抗外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。内部氨基修饰：主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶）。 5'氨基修饰： 5'Aminolinker(C6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学反应添加到引物5'糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5' C6氨基修饰可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重标记诊断系统，目前主要用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物。 3'氨基修饰：目前提供3'C7氨基修饰，它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。巯基（Thiol）： 5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下制作巯基连接的荧光探针。 5'巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite），用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。生物素（Biotin）：生物素修饰的寡核苷酸能紧紧地结合在链霉亲和素蛋白上，链霉亲和素蛋白可以标记上荧光染料和酶或作为附着的中间结合物附着在固体物生物表面，不同的分子生物学和纯化方法都包含生物素修饰。生物素修饰可以利用C6或是TEG间臂被添加在寡核苷酸的5’或末端，生物素TEG需要纯化，中间的生物素修饰可以通过dT碱基加入，这种形式需要更多的纯化步骤。引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。地高辛（Digoxigenin）：地高辛是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质，因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源，所以抗地高辛抗体不会结合到其他生物物质。地高辛经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置。杂交的地高辛探针可以由抗地高辛抗体来检测，这个抗体一般会与碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素或胶体金偶连。或没有偶连的抗地高辛抗体但偶连的抗体。地高辛标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southern blotting）、DNA-RNA杂交（Northern blotting）、斑点杂交（Dot blotting ）、克隆杂交、原位杂交及酶联免疫分析（ELISA）。间臂（Spacer）： Spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。 C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。 3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 Spacer 18常用于引进一个强疏水基团。查看更多

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抗体制备法的利与弊，了解一下? 单克隆抗体一直是基础研究、医学诊断和疾病治疗中的重要工具。制备单克隆抗体的传统方法，是诺贝尔奖获得者Georges K?hler和César Milstein在上世纪七十年代开发出来的。这一方法包括：让小鼠接触特定抗原，收集它体内的抗体生产细胞，然后将这些细胞与骨髓瘤细胞融合，形成能够长时间体外培养的杂交瘤。这种技术可以帮助人们生产大量高度特异性的抗体。然而，动物源的抗体不能用于人体治疗，因为它们会触发人体的免疫反应。为了在人体免疫细胞应答特定病原体时，获取细胞产生的抗体，科学家们又开发了一些新的方法。例如，从血样中分离记忆性B细胞，然后利用Epstein-Barr感染使这些细胞具有永生能力，再在其中筛选能够生成特异性抗体的细胞。“这个方法非常费劲，因为你要制备这些细胞系，对大量的细胞进行筛选，”芝加哥大学的免疫学副教授Patrick Wilson说。另外，不是所有的细胞都能在永生化过程中存活下来，这无疑限制了天然抗体的产量。最近Wilson等人找到了一个新办法，他们从活跃应答病原体或疫苗的人类血液中，分离具有抗原特异性的单个B细胞，然后对细胞中编码抗体重链和轻链的两个基因进行克隆。这些基因的序列在不同细胞中是有差异的，“不能把细胞混在一起，因为那样你可能得到一个细胞的重链和另一个细胞的轻链”，这样就不能获得天然的重轻链组合。克隆了两个基因之后，就可以在此基础上生产重组抗体，这一技术也被称为表达克隆（expression cloning）。“这个技术没什么限制，只要分离到B细胞就可以制造相应的抗体，”Wilson说。“问题在于实验的步骤比较繁琐。” 表达克隆法最适合“在获得了大量抗原特异性细胞时使用，而这些细胞只有在疫苗接种或感染之后才会出现，”Wilson说。如果没有产生活跃的免疫应答，这个技术鉴定抗体就会非常吃力。因为血液中存在着数百万记忆性B细胞，它们都针对着不同的抗原。上述技术都是鉴定新抗体和研究人类免疫应答的宝贵工具，不过这些技术都很耗时也比较复杂。为了加快抗体研发的速度，The Scientist杂志联系了相关领域的一些专家，请他们分享了自己使用新兴技术进行抗体鉴定和分离的经验。基于细胞培养的方法!--?xml:namespace prefix = "o" ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /-- 使用者：NIH国家过敏与传染病研究所的Mark Connors 项目：分离广谱而且强效的新HIV中和抗体遇到的问题：HIV患者的抗体生产细胞永生化效率较低，就算成功永生化，一些克隆也并不稳定。此前有研究者通过荧光探针从血样中提取抗原特异性的记忆性B细胞，并由此获得HIV中和抗体。Connors及其团队希望在不依赖已知抗原的条件下，寻找新的HIV中和抗体。（延伸阅读：PNAS：常用HIV药物难以深入淋巴组织）解决办法：Connors及其团队首先使用流式细胞仪从HIV感染者的血液中分离B细胞。他们并没有采用常规的表达克隆（克隆各个细胞的重链和轻链基因），而是将分离到的细胞分装在384孔板中。他们用滋养层细胞和信号分子保持B细胞的活性，同时刺激它们分泌抗体。在大约两周后，研究人员检验了每个孔上清液在体外中和HIV的能力。随后，他们选取了有中和能力的细胞，并对其中的抗体基因进行克隆，最后制成重组抗体。Connors和他的团队用这一方法，分离了两个能够强力中和多种HIV病毒株的新抗体。优点： ?使用者不需要事先知道抗体的结合特异性 ?可以用于多种疾病。“只要你有能够进行筛选的目标功能，就可以提取抗体，” Connors说。 ?完成整个过程只需要三周，Connors说。 ?滋养层细胞可以通过AIDS reagent program免费得到缺点： ?中和分析所需的试剂比较贵 ?理论上这一方案可以手动完成，但需要筛选的孔很多（Connors筛选了60,000–140,000个孔），因此这一技术更适合拥有自动化液体处理设备的实验室。 ?一些抗体生产细胞可能在培养过程中无法存活。成本：据Connors估计，每个384孔板大约需要$400–$500。手动操作一般需要约20块板，自动化实验操作一般需要60–80块板，具体还是要看血样中有多少B细胞。高通量DNA测序使用者：德克萨斯大学的George Georgiou教授项目：用高通量测序鉴定天然的人类抗原特异性抗体遇到的问题：2010年Georgiou的研究团队向人们展示，可以通过免疫球蛋白基因的高通量测序，快速生产抗原特异性的抗体。随后，研究团队对小鼠进行免疫接种，然后选取了抗体生产细胞中表达量最为丰富的重链和轻链基因，将它们重组成为抗体。但这一方法无法辨别抗体生产细胞中的原始重/轻链配对。Georgiou发现，要想构建天然抗体，就要找到同时测序重链和轻链的方法。解决办法：Georgiou的研究团队先用流式细胞仪从血液中纯化B细胞，将细胞一个个分配到125皮升的微孔中。随后他们裂解细胞，并用磁性微珠捕获重链和轻链的可变区mRNA（VH 和VL）。对这些mRNA进行PCR扩增，可以将VH和VL转录本结合在一起形成一个cDNA扩增子。在此基础上，研究人员可以通过测序和生物信息学分析来确定VH: VL的配对情况。研究人员利用这一技术，在应答破伤风类毒素的抗体生产细胞中鉴定了86个重/轻链对。他们选择其中的10对制备了10种重组抗体，结果这些抗体都能够在体外与破伤风类毒素高亲和力结合。而之前的研究显示，通过重链和轻链随机配对生产的抗体，只有大约10%具备抗原特异性。优点： ?非常快。“从分离细胞到获得全天然的人类重/轻链序列，只需要一周时间，”DeKosky说。 ?可以鉴定抗体的天然序列 ?不会漏掉罕见B细胞所编码的免疫球蛋白 ?可以在免疫应答的过程中跟踪B细胞的发育缺点： ?需要自制微孔芯片 ?进行序列分析需要具备一定的生物信息学知识成本：据DeKosky介绍，获得2,700对抗体基因序列，需要大约$550的试剂。蛋白质组学技术使用者：CST公司的首席科学家Roberto Polakiewicz 项目：鉴定实际存在于人类和动物血液中的抗体，并在此基础上生产具有高亲和力的重组抗体遇到的问题：以细胞为基础的抗体制备策略（不论是B细胞永生化、表达克隆还是测序）都不能代表血液中真实存在的所有抗体。这是因为，有些细胞会在分离过程中死亡，而有些细胞编码的抗体可能并不释放到血液中去。“我们制备抗体的目的是对抗感染，” Polakiewicz说，所以“真正重要的是血液循环中的抗体，这些抗体才负责发现病原体并召集免疫细胞展开攻击。”为此，Polakiewicz及其同事希望开发一个策略，直接分析血液循环中的抗体。解决方法：Polakiewicz的研究团队采用了蛋白质组学技术。他们先通过亲和纯化，从接种过乙肝疫苗的血液中分离和富集特异性的抗体。随后，研究团队用蛋白酶将这些抗体消化成多肽片段，并对它们进行质谱分析。为了解读这些质谱数据，研究人员测序了供体B细胞的抗体基因，并在此基础上建立了参考数据库。“不能使用整个基因组，” Polakiewicz说。“那样会给你生殖细胞系的B细胞序列，而我们需要的是免疫接种后从头生成的序列。” 通过比较免疫球蛋白的基因序列与多肽的质谱数据，研究人员鉴定和克隆了血液中的抗体重/轻链基因，并由此生产了多种重组抗体，这些抗体都能与乙肝病毒抗原高亲和力的结合。优点： ?能够分析人体血液循环中出现的抗体成分 ?可以用来跟踪血液抗体谱发生的变化缺点： ?需要自制进行多肽和基因序列分析的生物信息学软件 ?破坏了血液中抗体重/轻链的天然配对。 ?需要使用者具备测序和质谱的专业知识 ?比较费力，生成功能性的重组单克隆抗体需要21天成本：Polakiewicz未能估算出这一方案的具体成本，但他指出这一方案的花销跟常用的方法差不多，甚至还可能更低一些。查看更多

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微量采样技术在药物分析上的作用? 在进行生物技术药物研发时，开展生物药物分析是保证药品质量的重要环节，也是一项常规的工作内容。一般来说，药品检验的工作程序包括取样、形状检查、鉴别试验、纯度检查、含量测定等等，生物技术药物的质量检验的程序与化学合成药物的基本相同。今天我们来了解一下微量采样技术。原则上来说生物样品包括各种生物体液和组织，然而在实际中，最为常用的是血液包括血浆、血清或全血，尿液和唾液等，这些样品比较容易得到。生物样品中的药物及其代谢物的检测，称为生物药物分析，在开展生物药物分析时，为了提供给生物定量分析足够的样品如血浆样品，往往需要消耗大量的全血。而在单只试验动物身上仅能采集系列样品的量非常有限，因此常常需要使用混合样品进行代替。混合样品的使用可能导致pk研究的数据可靠性下降，和对动物的需求量增加。体内样品大都具有采样量少、待测物浓度低、干扰物质多等特点，因此在进行生物药物分析的特点具有体内样品需分离与浓集，或经化学衍生化处理后才能进行分析，对分析方法的灵敏度及专属性要求较高，分析工作量大、测定数据的处理和结果的阐明较为繁杂等特点。美迪西生物分析服务部门拥有专业的科研团队，分析实验室配置先进的仪器设备，实行全面的信息化管理，实验研究符合FDA/CFDA GLP标准要求，服务内容涉及药代动力学、药效学、免疫原性和生物等效性等研究方面，为客户提供小分子药物、生物制剂、疫苗和生物标记物的筛选与开发，以及临床前和临床研究。在生物分析时，抛开血浆样品的运输和储存中需要冻存及妥善处理不说，用于生物药物分析的血浆还要从全血中进行分离和制备，而通过固相分离、液液分离或者蛋白沉淀的方法进行分离的步骤又非常耗时，从而限制了检测通量和最终的样品检测数量。随着科学技术的发展，新型高灵敏与高分辨的质谱的兴起，使得生物和医学分析中实际需要的样本量更小了，为微量采样技术的发展提供了广阔的发展空间。干血点（DBS）采样法是一种采集生物样品的新型替代技术，DNS法采血量小，因此特别适合小动物的连续样品采样。随着LC-MS/MS对分析灵敏度和重现性的不断提高，使用LC-MS/MS用于DNS样品的定量分析，为在生物药物分析中的临床前药动学的研究提供了可靠的技术支持。例如从上世纪八十年代发展起来的一种微量生物化学采样、检测技术—— 微透析，是现代医学发展起来的一种新型生物化学采样技术。它可以对活体组织细胞外液进行生物化学采样，几乎适用于所用小分子活性物质的分析。而且对组织损伤极小。由于该技术具有活体取样、动态观察、定量分析、对组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测且易实现自动化等优点，因此在国外已被广泛应用于各个基础医学研究领域，对医学、药学、生命科学等领域，提供了崭新的技术的发展空间。相比较传统的血浆采样方法，使用微量采样技术具有采血量少、特别适合小动物的血样采集，方便血样采集、存储运输等优势，因此在生物药物分析上的应用前景广阔。查看更多

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钱要花在刀刃上，基因组测序如何省钱? 坦率地说，基因组测序中最昂贵的部分是测序本身。测序仪的消耗品成本（包括测序芯片和试剂）明显盖过了测序的其他成本，更不用提一开始的资本支出。当然，钱要花在刀刃上，无论我们是拥有自己的仪器还是借用别人的仪器，都有办法来削减成本。在此，我们梳理了测序的整个流程，从样本制备到数据分析，看看可以在哪些地方减少开支以及这样做的隐性成本有哪些。一般来说，通量较低的Illumina测序仪的购买和维护成本比较低，而耗材成本也相应较低。从另一个角度来看，高通量的测序仪能够产生大量的数据，使得每Mb或每个样本的成本降低。GenapSys的CEO Hesaam Esfandyarpour指出，无论采取哪种方式，由于每次运行的耗材成本是固定的，因此让测序仪满负荷运行才是上乘之选。这样，样本不多、通量较低的研究人员就可以先选择浪费容量（其实也就是浪费钱），等待样本量逐渐上去。或者，他们也可以选择外包服务。外包当然更省事，但需要服务费，从送样到拿回数据还需要一段时间。其实，大家在仪器上还有更多选择，比如最近上市的GenapSys测序仪。这台测序仪在美国的售价低于一万美元，且每次运行的耗材成本仅为几百美元。它的平均读长超过150 bp， 80%的碱基质量高于Q30。利用16M芯片开展测序，每次可产生1.2-2 Gb的数据。Esfandyarpour认为，每个研究人员都可以拥有DNA测序仪，并自行决定运行样本的方式。选择外包？外包也是一门艺术。就外包服务而言，它有许多不同的切入点。GE Healthcare的技术经理Andrew Gane表示，有些人会直接提供样本，而有些人会提供制备好的文库，让供应商上样到仪器中。对于那些愿意自己动手的研究人员而言，节省成本的机会出现了。某些实验达人甚至会自行开发平价的解决方案。他们会考虑，操作方案中的哪些步骤是必需的，有没有办法跳过一些？实验过程中是否需要保真度最高的酶和最好的磁珠来进行PCR扩增和DNA片段筛选？有些研究人员，特别是开展单细胞测序（scRNA-seq）的研究人员，可能会选择同时分析多个样本。加州大学旧金山分校Genomics CoLab主任Walter Eckalbar指出：“在10x Genomics平台上开展单细胞基因组学分析，每次样本制备的成本约是1,500美元，而bulk RNA-seq的成本大约是100美元。” Gane表示：“目前有多种方法可以在多重分析之前或分析期间对样本进行归一化，从而减少质量控制的时间，”不过这些方法也会带来其他成本。 Eckalbar认为，在确定特定工作流程的实际成本时需要考虑多个因素。其中包括总共有多少个步骤，是否有附加的步骤（比如在Bioanalyzer上进行QC），是否需要购买额外的磁珠，甚至是否符合标准的工作日安排。自动化操作通过自动化，实验小量化（miniaturization）也更容易实现，而这又是节省试剂的一种方式。“如今，我们不再按照试剂盒操作手册上规定的体积来操作，而是利用液体处理系统进行1/2或1/4体积的反应，有时甚至是1/10，这在手动移液时很难做得到。”他说。“而且，自动化系统可以实现更高通量的操作，比如384孔板或更高。” “小量化也存在缺点，在大多数情况下，你会牺牲一些数据质量，从样本中检测到的基因数量可能会减少，”Eckalbar说。“不过好处是，在预算不变的情况下，你可以分析更多的样本，从而具有更好的统计能力。” 数据解读在测序实验完成后，你还需要处理数据。处理数据的方式有很多，包括测序公司提供的云端分析app（免费或付费）、第三方提供的商业化数据分析解决方案，以及提供数据分析服务的供应商。具体选择哪个，这可能要取决于问题的复杂程度和研究人员的熟练程度。 Eckalbar指出，许多免费和付费的解决方案可能都存在限制，出于种种原因，你的数据可能不适合。这时候，你不得不将数据交给专业的机构去分析。不过，“许多硕士生和博士生都在努力学习这些生物信息学工具，以便亲自上阵”。查看更多

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最亮的细胞转染怎么做? 做转染实验时小编就抱着一个信念，就是要给细胞点“颜色”看（荧光），但你知道吗？就这个简单的实验过程，小小的细胞却有着大大的能量，实验过程中带阳离子的脂质体充当着“搬运工”的角色将质粒从胞外“抓”到胞内，而细胞为质粒的复制、转录、翻译提供“场所和原材料”，自己也跟着“增光填色”,但“上色”过程中会遇到一些问题，总结下来主要有以下二个方面：细胞状态差转染效率低 Q1：转染后细胞状态较差 A：分析：主要是铺板和反应液配制的原因细胞状态是整个实验的关键，如果细胞状态不好，则转染后细胞状态当然就好不了铺板：过多或不均匀，细胞长的太满就会状态较差脂质体本身有毒性，如果脂质体加入量太多，会导致细胞状态较差，或者细胞死亡，建议在做正式实验前，先做一下预实验，摸索一下质粒和脂质体的配比。 Q2：转染后荧光效率低 A：分析：主要是细胞原因和“搬运”过程中的问题 1、细胞状态仍然是重中之重，如果有一段时间转染效果很不理想，必须要换一批次细胞； 2、加入目的质粒后轻轻混匀，太用力会破坏混合液的结构， 3、质粒与转染试剂的比值：过高一部分质粒不能进入细胞，过低“搬运工”太多，有毒性且浪费； 4、吸、打液体时注意枪头内液面高度，是否完全打出； 5、反应液配好后等待20min，质粒才会被完全包裹； 6、反应液滴加加入细胞，使“脂质体+质粒”均匀分布； 7、质粒反复冻融影响浓度，尽量减少冻融次数；脂质体 -20℃保存，用完应马上放回； 8、必要时需要检测一下质粒的浓度是否准确；查看更多

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血清沉淀了怎么办? 血清沉淀是什么？血清中经常会出现肉眼可见的沉淀，其成分有多种类型，产生的原因有很多，主要有纤维蛋白、磷酸钙还有一些其它成分。 1. 纤维蛋白（Fibrin）血清中肉眼可见的沉淀物大多属于这一类型。由于在生产过程中，血清采集、过滤（3 次 0.1 μm过滤）和灌装处理都是在低温条件下快速完成, 此时血清中纤维蛋白原（Fibrinogen）处于溶解状态。但在解冻之后, 血清中纤维蛋白原往往会发生凝集，形成肉眼可见的沉淀。下图是血清因反复冻融而造成纤维蛋白原的凝集 2. 磷酸钙（Calcium Phosphate）这是一种常见的沉淀成分，通常会造成血清出现云雾状浑浊。当产品在 37℃保存时，这种现象尤其明显，在倒置显微镜下可观察到小黑点的存在。这些小黑点在布朗运动的作用下四处游动，常被误认为是微生物污染。 3. 其他成分（Other）血清中的其他成分也会形成沉淀，例如胆固醇形成的油脂滴和其他蛋白沉淀等血清沉淀会影响细胞培养吗？ 1. 细胞生长我们在出厂前都会对血清进行一系列质检测试，确保血清质量达到严格标准。血清测试和细胞培养经验也表明，其沉淀成分不会影响血清作为细胞培养添加物的表现。这一点得到了众多客户和其他血清供应商的肯定。解冻之后, 血清中纤维蛋白原往往会发生凝集，形成肉眼可见的沉淀。 2. 怀疑污染磷酸钙颗粒经常会被当成微生物污染而引发不必要的担忧。一般情况下，当操作人员融化血清后注意到有雾状浑浊时，常将其存放在 4℃冰箱中观察，并考虑接下来是否继续使用。但这样会使沉淀进一步增多，反而会使血清更加浑浊，进而误以为存在血清污染。并且，在倒置显微镜下，可在血清中观察到四处游动的小黑点（磷酸钙颗粒的布朗运动），更容易使人误以为存在微生物污染。为防止这类误解的产生，我们不建议客户培养血清来验证是否存在污染，而是将血清直接接种在细菌培养基上进行培养，以观察是否有细菌的增殖。并且，进行革兰氏染色，并在油镜（100 X 10 倍）下观察可直接确认是否存在微生物污染。怎样操作可以尽量避免沉淀出现？ 1. 正确解冻首先，应按照逐步解冻的方式正确解冻血清：从-20℃取出后，置于 4℃冰箱缓慢解冻，最后置于室温完成解冻。如果直接从-20℃拿到室温或 37 ℃水浴解冻，则非常容易产生沉淀。在解冻过程中，请注意时不时缓慢摇晃瓶子，减少沉淀的产生。为避免反复冻融，建议您将血清分装使用。 2. 使用和保存注意事项血清沉淀很难预测和避免，出现沉淀后也无需担忧，这并不会影响血清的品质。已知血清沉淀在以下条件下会有增多的可能： 1) 热灭活； 2) 37℃培养； 3) 反复冻融； 4) 伽马射线照射； 5) 2-8℃长期保存； 6) 长期保存于可自动化霜的冰箱中（温度不稳定）。血清沉淀的形成机理多种多样，具体的机理尚不十分明确。我们尚不能准确预测和控制血清沉淀的产生。目前市面上所有品牌的血清产品都存在沉淀现象，这一点可以在各品牌官方网站上关于沉淀问题的声明上得到证实。出现血清沉淀该如何处理？我们建议您采用2000 rpm 离心5分钟，取上清使用就好，比过滤方便，不需要另外准备滤心和针筒，又不容易污染。总结：血清产品中出现沉淀属于常见现象，但不会影响血清的品质，对细胞培养而言也是没有任何问题的，大家可以放心使用！查看更多

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怎么评判胎牛血清标准? 外观好的血清应是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如发现血清浑浊，不透明，含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；若棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，有溶血现象。 2、总蛋白含量胎牛血清一般范围是30-40mg/ml，数值偏高，说明采血的牛龄偏大，不是胎牛；数值偏低，表明血清可能掺水了。 3、血红蛋白标准为不高于20mg/dl，颜色越红，数值越高；反之，数值越低。 4、pH 国产血清，大多高于7.5，进口胎牛血清，大多低于7.5，具体原因未知，可能和牛龄有关，这也能用来初步鉴别血清的来源。微生物包括细菌、霉菌、支原体、噬菌体、各类病原性病毒等。随着国内血清厂家生产条件的改善提高，细菌、霉菌等“大型”微生物几乎能100%控制，支原体经过0.1μm过滤，大多也能清除。大肠杆菌噬菌体的污染还是比较严重的，主要是生产环境过程中带入，又无法过滤，很难彻底清除，但对血清质量影响不大。病原性病毒，特别是BVDV，在国产血清中几乎90%以上都存在，这类微生物是影响国产血清质量的重要因素之一，而进口胎牛血清相对国产血清而言，检出率不高。 6、免疫球蛋白国产血清的只是定性检测，结果也很不准确，进口胎牛血清大多定量检测。免疫球蛋白的数值能完全体现出采血的时的牛龄情况，国产血清，基本都是新生牛的，血清中容易产生IgM，IgG的含量也偏高，进口胎牛血清，不含IgM，IgG的含量也较低。 7、抗生素含量此外，抗生素的使用也是要考虑在内的。国内外的血清，都不对抗生素进行测试（无四环素胎牛血清除外）。其中，由于国外抗生素使用较为严格，用量有限，同时每头奶牛的产品包括血清都可以追溯源头，所以国外胎牛血清不含抗生素或者含量极低。但是国内由于抗生素使用普遍，血清中残留量很高，导致国产血清质量很差，不利于细胞培养。血清来源市场上的血清血源主要分为中国、北美、南美和澳洲。而澳洲血清，来源主要是新西兰和澳大利亚，这是在北美血清禁运之后进入中国市场的，一般不具有溯源功能。查看更多

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标准品、对照品、内标物有什么区别? 一、概述实际工作中，一般用用液相色谱仪进行分析实验要用到对照品，标准品可以从试剂公司买，但有的物质是没有标准品的，大家就常说那是对照品，纯度都可以达到98%，那么对照品和标准品有没有一个严格的界定呢?还有做内标法说用的是内标物，这个内标物和对照品、标准品又有什么不同呢? 本文主要介绍对照品、标准品、内标物的区别。二、详细区别介绍 1、内标物将一个已知质量，样品中不含有杂质的纯物质，加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。内标物需满足下列要求：能完全溶解于样品中，且不与待测组分发生化学作用;峰位尽可能与待测组分的峰位靠近，但能与待测组分完全分开(分离度R≥1.5)的纯物质。若得不到纯品，必须预先测定其准确含量，且杂质峰不得干扰待测组分峰。此外，还应满足以下条件：（1）内标物应是该试样中不存在的纯物质; （2）它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离; （3）加入内标物的量应接近于被测组分; （4）色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。 2、对照品对照品是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，采用化学方法来测定，即是一般仪器的都叫做对照品。对照品分为官方标准品和工作对照品，试剂公司买的不能作为正常的对照品使用，必须经过标定之后才可使用。举个例子，药典规定若是血液制品，用来对照的叫标准品，若是药材，用作对照的叫对照品。 3、标准品标准品系指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位(或μg)计, 以国际标准品进行标定;对照品除另有规定外,均按干燥品(或无水物)进行计算后使用。引申阅读：标准品、对照品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质。标准品与对照品(不包括色谱用的内标物质)均由国务院药品监督管理部门指定的单位制备、标定和供应。标准品与对照品的建立或变geng其原有活性成分和含量，应与原标准品、对照品或国际标准品进行对比，并经过协作标定和一定的工作程序进行技术审定。标准品与对照品均应附有使用说明书，标明批号、用途、使用方法、贮藏条件和装量等。查看更多

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琼脂糖凝胶电泳的原理及实验过程? 实验原理琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子；聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最好，且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶，可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整体效果都若于传统的EB。材料、试剂及器具 1、材料合适的Marker（分子量标准）；DNA 样品 2、试剂加样缓冲液（6x或10x）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）。 3、器具（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。（2）凝胶成像系统或紫外透射仪。实验过程 1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，选择合适的比例的凝胶，称取适量的琼脂粉，放到一锥形瓶中，加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。待胶液却至 60℃左右，在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。 2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。 3、待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。 4、在槽内加入TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。 5、把待检样品，按合适比例与加样缓冲液混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。 6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节合适电压，稳压输出，开始电泳。 7、观察溴酚兰的带（蓝色）的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时，可停止电泳。 8、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm 或 254nm），通过观察孔进行观察。注意事项 1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。 2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右，且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加 EB，建议选择EB溶液浸泡染色。 3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。 4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度，已实际电泳条带运动速度为准。常见问题分析常见问题原因对策 DNA条带模糊 DNA降解实验过程避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换 DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量 DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白 DNA变性电泳前勿加热，用TE缓冲液稀释DNA 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往PCR体系需要优化，PCR程序需要摸索。其对策有：调整PCR体系和PCR程序，摸索出合适的条件。不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换 DNA变性电泳前勿加热，用TE缓冲液稀释DNA 带弱或无DNA带 DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低 DNA降解实验过程避免核酸酶污染 DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源 DNA带缺失 DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度 DNA变性电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNA DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析电泳时Ladder扭曲配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可电泳时电压过高电泳时电压不应超过6V/CM 查看更多

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如何评价和选择支原体检测试剂盒? 要选一款合适的支原体检测试剂盒，有如下几个评价指标： 1. 灵敏度。灵敏度常用支原体基因组的拷贝数或支原体菌株的CFU表示。 2. 特异性和广谱性。质量好的试剂盒应检测的支原体物种越多越多，并且特异性强，即只针对支原体，不针对其他细菌等微生物，没有交叉反应。 3. 稳定性。冻干粉比液体试剂的稳定性高。 4. 样本类型及样本处理。一款好的试剂盒，会标出它适合的样本类型，也会说明如何处理样本。要注意有的样本含有抑制PCR反应的物质，因此需要处理。 5. 对照品。一个好的试剂盒，会带有阳性对照和内控对照。内控对照是用于监测PCR是否正常。如果样本含有抑制PCR的物质，则内控对照的条带会发生缺失。有严重支原体污染的样本由于样本中的支原体对内控对照产生了竞争性抑制，因此支原体条带越强，内控条带越弱（下图）。图. 1. 100 bp DNA Ladder；2. 阴性对照，有内控条带；3. 阳性对照，有支原体阳性条带；4. 样本有PCR抑制剂；5.阴性样本；6.阳性样本，支原体污染较轻；7.阳性样本，支原体污染较重。图片来自Minerva Biolabs公司生产的Venor?GeM Advance支原体检测试剂盒说明书但支原体核酸检测法（NAT）并没有载入我国药典。我们药典指定的是支原体培养法和DNA染色法。但2018年《中国药事》第8期上，中国食品药品检定研究院刊发了一篇文章——《支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考》，提出提出要与国际接轨，逐渐推进NAT的开展，因其“具有快速、灵敏、便捷等特点”。欧洲药典规定，核酸法如替代培养基，核酸法的灵敏度需达到10 CFU·mL-1；如替代DNA染色法，核酸法的灵敏度需达到100 CFU·mL-1。该文也提出，需对NAT进行特异性、最低检出限和耐用性的验证。因此，对于需要NAT法检查支原体的生物制品和细胞治疗产品企业，可选择试剂盒已经验证并提供有参比物质的知名品牌厂家，尽管后续仍需按照待测样本类型进行方法的适用性验证，并同步开展药典方法的平行检测研究，但已为NAT法检查支原体带来极大的方便。查看更多

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小试剂大作用，培养细胞最关键是什么? 一、万物的生长离不开水，细胞也是一样的，若要它生长，必须要用新鲜的双蒸水，不含任何杂质和有离子等成分。二、PBS（也可用BBS、如：Hanks D-Hanks液配置）-此产品主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗。Sciencell的DPBS（SicenCell No.0303）是一种无毒、无渗合物的缓冲液，它不包含Ca2 +, Mg2 和酚红并且通过0.2μm过滤消毒，可用于冲洗细胞而不会造成损伤。三、胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样，胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在PH值为8.0，温度为37度时，胰酶溶液的作用能力最强。所以使用胰酶时。应当把握好时间，浓度和温度。因Ca2 +, Mg2，血清和蛋白质会降低胰酶的活性，所以配置胰酶时尽量避免使用含有这些物质的水剂。sciencell 胰酶（SCIENCELL No.0103）含有0.25%EDTA，(EDTA)是一种螯合剂，能螯合Ca+2、Mg+2等金属离子，促进胰蛋白酶化反应。（ScienCell No.0183）0.05%胰蛋白酶加EDTA溶液(T/E)是一种无菌、磷酸盐和缓冲盐水溶液。此胰酶适用于原代细胞的消化。终止消化时，可用含血清的培养基或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞产生的作用。四、内皮细胞涉及多个血管生物学的范畴，是众多科研研究的热点，它不仅能完成血浆和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。原代的内皮培养除了需要特制的内皮细胞完全培养基外在培养的时候还需要使用包被液，以促进细胞的贴壁和增殖能力，能更大量的得到更多的细胞。ScienCell牛血浆纤维连接蛋白直接从牛血浆纯化而来，未经过任何化合物干扰，使用可让细胞更自然的生长。五、原代细胞冻存很关键，因为一不留神就会复苏不活，一冻回到解放前，DMSO是常用的冻存细胞的试剂，但是因为其具有挥发性，毒性，不好掌控，而导致很多科研者在细胞冻存之后自我感觉冻存没有问题，但是复苏起来却一个活细胞也见不着。为了避免这种尴尬的问题出现，sciencell细胞冻存液专为人源及动物源细胞冻存提供，此产品含DMSO、胎牛血清等细胞内外保护剂，在冷冻保存过程中进一步提高细胞活力。查看更多

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如何分离纯的肺泡上皮细胞? 肺泡上皮细胞(AECs)是肺细胞的主要类型之一，可用于分析肺上皮细胞对外界因素的反应。因此，小鼠肺部的AECs可以作为疾病的体外模型。AECs对于研究肺的发育、损伤和修复是必不可少的。从事呼吸系统疾病如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、囊性纤维化、肺气肿和肺炎研究的人员通常依赖AECs进行研究。一、AECs需要特殊处理第一次分离小鼠肺泡上皮细胞是很棘手的，肺上皮细胞周围有大量的白细胞和内皮细胞需要分离。更复杂的是，AECs需要通过分散酶消化而从肺的细胞外基质中释放出来。分散酶能特异性地裂解存在于AECs基底膜中的IV型胶原蛋白和纤连蛋白，需要通过气管艰难地注入。二、区分肺泡上皮细胞的类型肺泡上皮细胞有两种类型：I型肺泡上皮细胞(AECI)和II型肺泡上皮细胞(AECII)。 AECI很薄，是一种细长的鳞状细胞，主要帮助肺泡和血液之间的气体交换。AECII是一种小立方形的细胞，分泌肺表面活性物质以降低肺泡表面张力。由于AECII更丰富(大约占ACEs的60%)，它们比AECI更容易分离。因此，大多数人从肺中分离出初生AECII细胞，然后对它们进行分化，以获得AECI样表型。三、从小鼠肺中分离AECII细胞分离肺泡上皮细胞最著名和广泛遵循的protocol是由M. Corti和他的同事描述的, 为了达到高纯度，不同的小组对原始协议进行了修改。如下分享一些小技巧，将帮助优化您的细胞分离方法，以获得那些 90%的纯细胞。优化消化步骤在肺提取步骤，优化肺组织在分散酶的孵育条件，因为它是肺组织成功消化的关键步骤，影响产量。经过尝试，最终优化得到最适条件，37℃孵育20 min，在2ml分散酶中连续旋转。优化上皮细胞的分离肺组织消化后，获得单细胞悬液。为了从所需的上皮细胞中分离血细胞，使用Corti等人推荐的CD45和CD16/32抗体浓度。但Corti研究中提到的磁珠分离系统比较旧，尝试使用Promega公司的链霉亲和素包被的磁珠和相应的分离柱。这种磁珠分离装置也可用于纯化其他类型的细胞(如污染白细胞中的内皮细胞)。优化上皮细胞的纯化根据Corti 的protocol, 磁性柱中CD45和CD16/32阴性群体(上皮细胞)可进一步纯化，在培养皿中37℃培养4h -16h。很明显，这种长时间的孵化需要优化。细胞培养分别采用4h、8h和16h，并监测它们的纯度。有趣的是，4小时后已经用流式细胞仪观察到了 90%的纯度。虽然较长的培养时间导致相同的纯度，但由于上皮细胞附着在培养皿上，导致产量下降。细胞纯度的最后检查 4小时后，细胞可以从培养皿的上清液中收集。使用Corti等人的协议，以及概述的优化步骤，获得的AECII细胞应该是高纯度的(大约90%)，使用流式细胞术通过上皮细胞粘附分子(EpCAM)染色可进行检测。然后，它们可在气道上皮培养基中37℃下5% CO2进行培养。使用这种特殊培养基的优点是它支持生长而不需要添加FBS。含有FBS的培养基可以引起细胞的自发激活，在实验室中是需要避免的。这些高纯度的AECII细胞可以直接用于实验，也可以进行分化，分化为AECI，通过在5% CO2、37℃，在纤维连接蛋白包被的培养板上培养7天。查看更多

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简单实用的细胞冻存方法? 冻存液：一般用10%DMSO(推荐用sigema原装的，质量好不用预消毒)+10％血清的完全培养基，如果细胞珍贵的话最好用10％DMSO＋90％全血清。降温方法：用最少两厘米厚的医用棉纱将冻存管紧紧包裹，扎紧，直接放入-70度冰箱，隔夜取出冻存管直接放液氮冻存。复苏效果对比：细胞冻存2周后复苏，本方法冻存的细胞与使用程序性降温仪冻存的细胞复苏效果相差不大，但明显比传统4度、-20度、-70度的方法要好，传统的冻存方法不但费时费力，而且各时间段的放置时间并无严格统一，尤其在4度和-20度时间不好掌握。要点：面纱包裹一定要足够厚，细胞用冻存液重悬后不要在常温放置太长时间。从-70度取细胞的时间无严格控制，我们曾经放过一个星期后在入液氮，同样可以顺利复苏。查看更多

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细菌裂解的操作步骤? 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至zui慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 3.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。查看更多

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酵母粉、酵母提取物、酵母浸粉和酵母浸膏的区别您知道吗? 在给许多客户介绍酵母浸粉时，很多人都会将其与酵母粉混为一谈，经常会问：“ 酵母浸粉不就是酵母粉吗？”“酵母浸膏和酵母浸粉哪个好呢？” 首先我们了解一下什么是酵母粉、酵母浸粉和酵母浸膏吧！酵母粉含义：一般是指灭活的酵母，产品成分主要是失去活性的酵母菌体，营养成分包括仍然包裹在菌体内部的粗蛋白、胞壁多糖以及丰富的维生素、生长素、微量元素等。酵母粉分类：分糖蜜酵母粉与啤酒渣酵母粉两大类，前者专门发酵生产并干燥制成，以糖蜜为主要原料，品质好且质量稳定；后者采用啤酒生产的废料－废啤酒酵母泥为原料，一般采取滚筒干燥制成，成本较低，但杂质较多，酵母细胞较老化，微生物不易吸收利用，品质不稳定。酵母粉主要在传统的抗生素等发酵行业应用较广泛。酵母粉特点：微生物对酵母粉的营养物质利用率与利用速率较低，发酵完毕后不能利用的残留物（粗蛋白与菌体细胞壁）较多，难以处理。酵母浸粉含义：又称酵母提取物，是采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色干燥粉末。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。酵母浸粉吸湿性，请放阴凉干燥处保存。酵母浸粉当中含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，酵母浸粉当中含有丰富的B族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。在当中它起的主要作用是补充氮源和提供细菌生长的各种维生素及氨基酸。酵母浸粉分类：同样可以采取糖蜜发酵的糖蜜酵母和啤酒生产的废啤酒酵母泥为原料生产。糖蜜酵母生产的酵母浸粉一般品质较高，这一方面是糖蜜酵母发酵经过专业的生产控制，原料品质就比较高，另外啤酒酵母粉为原料也有利于酵母积累更丰富的天然营养成分。另外一方面是以糖蜜酵母为原料的酵母浸粉生产规模可以做的很大，生产厂家可以充分采用先进的生产工艺设备与技术，从生产技术的角度保证酵母浸粉产品的高品质。酵母浸粉特点：酵母浸粉的生物利用度高，微生物的利用速率快，特别有利于对发酵培养基比较挑剔的营养缺陷型、基因重组工程菌的吸收利用，有助于缩短发酵周期，提高微生物发酵效价；同时发酵残留非常少，有利于发酵废液的环保处理。酵母浸粉主要用于微生物培养基制备的基础原材料以及生物制药发酵。酵母浸膏以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色精制浓缩而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的膏状产品。废啤酒酵母泥生产的酵母浸粉品质一般要大大差于糖蜜酵母浸粉，这主要是因为废啤酒酵母泥本身是啤酒生产的副产物，不存在什么质量控制；另外一方面是废啤酒酵母泥不能长途运输，生产厂家一般只能依赖周边啤酒厂的有限供应，生产规模难以扩大，因此限制了厂家的投资规模，一般只能土法上马，难以把生产技术装备以及所能采取的技术手段提升到理想的状态，导致产品色泽较深、不溶性杂质较多，维生素、生长素等微量营养物质的含量也比较欠缺。酵母粉和酵母浸粉是完全不一样的产品，更不能混为一谈。酵母浸粉和酵母浸膏的区别在于酵母浸粉经过高温瞬时干燥所损失的营养成分比酵母浸膏长时间浓缩所损失的营养要少得多，所以酵母浸粉在实际使用中用量更经济，且使用方便，也更易于运输和保存。酵母浸粉和酵母浸膏应用领域食:品饲料领域、动物营养领域、生物发酵领域、营养保健领域、发酵工业领域：可用于抗生素新药、多肽、核苷酸、B族维生素、生长因子、氨基酸、有机酸、酶制剂、生物防腐剂、原料药、VC及肌苷、生物材料、维生素、微量元素、基因工程等生物工程产业。为微生物发酵培养提供全面均衡的营养;、微生物培养基:假单胞杆菌、醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸链球菌、葡萄球菌、酵母及支原体。查看更多

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ATCC细胞解冻和培养指南? 细胞解冻和培养指南冻存的ATCC细胞株和杂交瘤细胞株在运送过程中使用干冰保持低温。收到冻存细胞后，可以立即解冻复苏，去除二甲基亚砜（DMSO）后进行细胞培养。如果不立即复苏培养细胞，必须将细胞冻存管放置于液氮罐气相层存储。请不要将细胞存储在-130℃以上的温度。如果温度不够低，达不到-130℃，细胞活力会迅速下降。操作推荐 ATCC推荐在操作冻存的ATCC细胞株时使用手套，工作服和防护面具以避免任何事故发生。检查包装，查看是否有任何破裂或渗漏。冻存的ATCC细胞株应处于固体状。将冻存的ATCC细胞株从有干冰的包装中取出，立即复苏培养，或迅速转移放置在液氮罐气相层在-130℃以下的温度存储。冻存细胞的复苏和培养 1、先准备好细胞培养皿或细胞培养瓶，及产品说明推荐的相应细胞培养基。并在37℃水浴中预先温热细胞培养基。（请参阅：注1） 2、小心取出装有细胞的冻存管，保持管盖拧紧，将冻存管盖以下的部分置于37℃水浴中并轻微的搅拌以帮助解冻。解冻过程应该尽快，大约短于2分钟或待最后一块小冰晶体刚融化，就应将细胞冻存管取出水浴。 3、在水浴中取出的细胞冻存管表面喷洒70%乙醇配制的消毒剂，用无菌纸巾或纱布拭干。之后的操作步骤都应该遵循在无菌条件下生物安全柜中严格操作。 4、小心拧开冻存管的顶部，将管内容物用1ml移液枪转移到含9毫升培养基的无菌离心管中。离心5到7分钟（125xg），小心吸去上清液以去除抗冻剂（二甲基亚砜），避免丢失细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于配好的完全培养基中。将细胞悬液转移到培养容器，轻轻摇晃使细胞均匀的分布。生长较慢的细胞株可重悬于5-8ml培养基并转移到T25培养瓶。生长较快的细胞株可重悬于12-20ml培养基并转移到T75培养瓶。 5、将细胞培养容器置于细胞培养箱，在温度37℃，二氧化碳浓度5%的培养条件下进行孵育。细胞培养24小时后应在显微镜下观察细胞形态和生长状况。（请参阅：注2） *注1：虽然大多数细胞株可以在一种以上的培养基中生长，但细胞的特征有可能会在更换不同培养基时发生。为保证最jia效果，请从细胞培养一开始就使用ATCC推荐指定的培养基。 *注2：某些细胞株，如杂交瘤株，可能需要几天的时间才从冻存状态下完全恢复正常生长。在细胞复苏培养第一天可能会呈现较低的细胞活力并产生一些细胞碎片。度过这一时期后，细胞会恢复并进入指数增长期。细胞培养贴士细胞株的生长有两种状态，贴壁细胞需要附着在一个表面进行生长（贴壁依赖性），悬浮细胞可在悬浮培养状态下生长（非贴壁依赖）。在细胞单层贴壁生长货悬浮生长中，都通常遵循四个特征性阶段：迟滞期、对数或指数期、静止或平台期及衰退期。查看更多

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科研人员在采购血清时都考虑哪些? 血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的必备营养，也是影响细胞状态的因素之一，所以选择一款合适的血清很重要。由于关乎着细胞活力和实验可重复性等重要参数，所以需要血清有稳定的质量。若质量不稳定，则很有可能导致实验失败。那么，科学家在选购血清的时候，需要考虑哪四个要点呢？ 1.是否有可追溯性对于科学家而言，最大的风险也许是FBS的纯度大打折扣，这可能导致细胞培养实验的效果不佳。许多FBS的卖家与多个产地签订短期供应协议来采集原材料，以便降低成本。他们将这些产品混合，“稀释”不同来源的影响。最终结果就是质量不稳定，产品供应和价格出现波动。 2.产品质量是否过硬对血清而言，产品质量很关键。由美国食品和药品管理局（FDA）执行的cGMP规范建立了完整体系，以确保制造过程和工厂的正确设计、监控和控制。在购买血清时，最好选择遵从cGMP规范的供应商，以便降低产品混合和标签错误的风险。 3. 产品价格是否稳定目前，全球对FBS的需求还在不断增加。每年，全球大约生产600,000 L的FBS，其中cGMP等级的不足200,000 L，而后者正是大多数工业生产公司的要求。随着大型制药公司的需求上升，FBS的价格也在持续上涨。此时，找到一家可以提供同批次FBS的供应商是十分必要的，这既确保了产品的稳定供应，也在一定程度上避免价格波动。 4.产品是否定期检测定期的产品检测当然也不能少。大家应注意产品的供应商是否定期进行生化、激素、病毒和功能方面的检测，包括检测细菌、病毒及其他微生物是否存在，以确保产品经过全面鉴定。质量控制检测也应当开展，以确保血清产品始终符合规定并合乎规格。查看更多

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电泳的作用各位了解吗? 在一定但不多的场合下，我们能听到电泳这个词汇。很多人的第一反应或许和小编一样，都以为是游泳的一种新方式。但是实际上，电泳和游泳是没什么关系的。不卖关子了，好奇的朋友就赶紧和小编一起来了解一下电泳是什么把！一、电泳是什么在一定的条件下，带电粒子在单位电场强度效果下，单位时刻内移动的间隔为常数，是该带电粒子的物化特征性常数[。不一样带电粒子因所带电荷不一样，或虽所带电荷一样但荷质比不一样，在同一电场中电泳，经必定时刻后，因为移动间隔不一样而彼此别离。分隔的间隔与外加电场的电压与电泳时刻成正比。在外加直流电源的效果下，胶体微粒在分散介质里向阴极或阳极作定向移动，这种表象叫做电泳。使用电泳表象使物质别离，这种技术也叫做电泳。胶体有电泳表象，证实胶体的微粒带有电荷。各种胶体微粒的实质不一样，它们吸附的离子不一样，所以带有不一样的电荷。二、电泳的作用 1、安全方面的效果奉献：电泳漆以水为溶解介质，无喷涂料的易燃易爆风险，大大地降低了涂装业火灾事故率，完结了涂装产业的安全！ 2、对涂装工身体健康方面的效果奉献：有机溶剂是涂装业中损害身体健康的首要来源，而电泳涂装大生产中有机溶剂含量仅为1~3%，大大降低了大气污染和环境损害，安全卫生。 3、漆膜功能方面的效果奉献：电泳涂膜厚度均匀，附着力强，涂装质量好，工件各个部位如内层、洼陷、焊缝等处都能取得均匀、滑润的漆膜，处理了别的涂装办法对杂乱形状工件的涂装难题，大大地延长了商品的使用寿命。 4、生产功率方面的效果奉献：电泳涂装生产功，可整挂商品或大件商品过电泳槽电泳1~3min即可取得均匀完好的涂布，远远高于喷涂的也许长达数几小时才干完结的涂装，质优高产，自动化接连大批量生产，大大地提高劳动功率；也一起大大地降低了工作本钱！三、电泳的工艺 1、除油。溶液通常为热碱性化学除油液，温度为60℃（蒸汽加热），时刻为20min左右。 2、热水洗。温度60℃（蒸汽加热），时刻2min。 3、除锈。用H2SO4或HCl ，例如用盐酸除锈液，HCl总酸度≥43点；游离酸度 41点；加清洗剂1.5%；室温下洗10～20min。 4、冷水洗。活动中冷水洗1min。 5、磷化。用中温磷化（60℃时磷化10min），磷化液可用市售制品。上述工序亦可用喷砂→水洗替代。 5、钝化。用与磷化液配套的药品（由出售磷化液厂家供给），室温下1～2min即可。 6、阳极电泳。电解液成分：H08-1黑色电泳漆，固体分质量分数9%～12%，蒸馏水质量分数88%～91%。电压：（70±10）V；时刻：2～2.5min；漆液温度：15～35℃；漆液PH 值：8～8.5。留意工件收支槽要断电。电泳过程中电流随漆膜增厚会逐渐降低。 7、清水洗。活动冷水中洗。 8、烘干。在烘箱中于（165±5）℃温度下烘40～60min即可。查看更多

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怎样区分干细胞和免疫细胞? 人体是一个庞大的细胞王国，里面居住着约40-60万亿的居民——细胞。由于医学技术的发展，我们逐渐了解到免疫细胞与干细胞的重要性，它们都在各自的领域内发光发热。可是，同样作为细胞，干细胞与免疫细胞又有什么区别和共同点呢？干细胞和免疫细胞又分别有什么作用？而如今大火的干细胞治疗与免疫治疗又是什么？今天，我们就来好好聊聊干细胞与免疫细胞的那些事。能力不同人体万金油——干细胞干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞。在一定条件下，可以分化成多种功能细胞或组织器官，因此也被称为“万用细胞”。当我们还是儿童时，干细胞源源不断的分化成各种新生细胞，为我们的生长发育、骨骼肌肉的形成提供原材料。在胚胎发展阶段，干细胞能分化成所有的特化细胞；在成体组织里，干细胞担任身体的修复系统，补充成体组织。健康卫士——免疫细胞比起干细胞，免疫细胞显得更加的争强好胜。在整个免疫细胞的大家族内，主要的功能便是围绕着清除其他细胞而展开，清除外来病原微生物、衰老细胞、突变细胞甚至癌细胞，都是免疫细胞的分内工作。每个人体内都存在着一定数量的癌细胞，每天都有新的衰老细胞、癌细胞产生。正是因为免疫细胞能够及时的清除它们，我们才能免于疾病的侵袭和癌症的发生。然而随着年龄的增加，免疫细胞以及干细胞的功能数量以及活力逐渐减退，但是不用担心，免疫细胞疗法以及干细胞疗法可以为我们保驾护航。职位不同免疫细胞疗法通过激活或增强人体免疫细胞的免疫疗法已经是目前最火的癌症治疗方式。除此之外，免疫细胞在癌症预防、抗衰老等领域的应用也正在研究中。干细胞治疗如果说，免疫细胞主要用于癌症治疗，那干细胞就更偏向于组织修复和慢性病治疗。以脂肪干细胞为例，除了在美容抗衰外还可以应用在各种疾病治疗方面。在老龄化日渐严重的情况下，脂肪干细胞也进入临床用于治疗阿尔兹海默症。在脊髓损伤和关节坏死等器官损伤时，都可以采用干细胞进行修复和治疗。不仅如此，在死亡率第一的心血管疾病中，脂肪干细胞也能针对急性缺血卒中进行治疗。尽管干细胞和免疫细胞在来源和功能以及应用方面都各不相同，但它们都在为人体健康，抵御疾病方面做出了贡献。相信随着日后更深入的了解，干细胞及免疫细胞将应用于更广阔的平台。查看更多

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简介

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个人简介：上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求”的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量”的方针。查看更多

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主营业务：质粒载体定制，ELISA检测试剂盒，细胞培养，抗体抗原，蛋白纯化，染色液溶液，标准品对照品,微生物培...

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