洛尘--盖德问答-化工人互助问答社区

洛尘

影响力73.10

经验值192.00

粉丝3

上海古朵生物

关注已关注 私信

他的提问 886 他的回答 845

影响电泳速度的原因有哪些? 影响颗粒电泳速度的因素 1．测试样品 (1)电荷在电场中，带电颗粒向各自相反方向的电极泳动。若同时带有正、负两种电荷,其移动方向取决于净电荷，其迁移率与净电荷的大小成正比。大部分生物大分子如蛋白质都带有阴离子和阳离子基因，是典型的两性电解质。带电的性质和多少取决于该物质的pKa、溶液的pH值及离子强度。 (2)颗粒大小、形状和分子量大的球形分子，在固相或凝胶稳定的基质中，在非常稀的溶液中，其迁移率与球的半径成反比。而分子量小于5000的肽类或离子，其迁移率与颗粒半径的平方成反比，或与其分子量的2／3次方成反比。其迁移率与颗粒净电荷和分子大小的关系,同样大小的分子，因其形状不同，如纤维蛋白与球蛋白，在电泳时，与周围介质的磨擦力和静电力不同，迁移率也不同。 2．电场强度电场强度是指每1厘米的电位降，故又称电位梯度，以V／cm表示。电场强度对泳动速度起决定性作用。在一定范围内，电场强度愈高，带电颗粒泳动愈快，根据不同电泳所需电场强度，可分为常压电泳和高压电泳。常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般为500～10000V。纸电泳、醋酸纤维电泳、聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳只需200～500V,而固相pH值梯度等电聚焦电泳则需要3000～5000V高压。电压与支持介质的长度有关，而电流与支持介质的横截面(或宽度)成正比。大部分电泳用恒压控制电场强度。在做管状圆盘电泳时，一般用调节每管的电流(mA)控制电场强度，在电泳过程中，保持稳定的电场强度或稳定的电流，是电泳成功与否的重要条件。 3．缓冲液 (1)pH值溶液的pH值直接影响带电颗粒的解离程度，并决定其所带净电荷的性质和多少。氨基酸、蛋白质均为可解离的两性分子，pH值离等电点越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度愈快。当在某一pH值时，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零时，蛋白质在电场中不移动。此时溶液的pH值，即为该蛋白质的等电点。因此，在分离蛋白质混合物时，应选择合适的pH值，使各种蛋白质所带的电荷差异较大而彼此分开。在电泳过程中，为了使溶液的pH值保持恒定，必须选用缓冲溶液。 (2)离子强度离子强度高，迁移率小，反之则大。但离子强度过低时，迁移率反而会因导电度的降低而减少，一般最适宜的离子强度为0.02～0.20。缓冲液离子强度的选择，取决于待测样品的组分。其缓冲作用应在整个电泳过程使pH值保持恒定。当增加离子强度时，使分离得到的蛋白区带更窄或斑点更为集中。 4．溶液的温度和黏度因溶液的黏度与温度有关，故温度间接影响电泳迁移率。在0～5℃时，温度升高l℃，水的黏度下降约3％，而在室温时，温度的改变对黏度影响较小。因此迁移率随温度的升高而增加。当电流通过支持介质和缓冲液时，会放出大量的热量，而热量随电压和离子强度的增加而加大，当热量增至一定程度时，其产生的温度梯度在电泳槽中会导致分离区带失真，故在使用高压和高离子强度缓冲液电泳时，必须使用冷却装置。 5．电内渗在电场作用下，液体对于固体支持介质的相对移动称电内渗(eletroendosmosis，EEO)。由于固体支持介质吸附水中的正或负离子，使溶液带电，在电场下，溶液就向一定的方向移动，产生电渗现象。如在纸电泳中，滤纸吸附羟基使表面带负电荷，而与纸接触的水溶液带正电荷，此时液体便向负极移动，并携带颗粒(包括中性颗粒)同时移动，故在电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的电泳速度与由于水溶液移动产生的电渗速度的矢量和。当电内渗向负极移动时，带正电的颗粒也向负极移动，则其表观移动速度将比电泳速度快，若颗粒原向正极移动，则表观速度将比电泳速度慢。为校正这一误差，可用中性物质如葡聚糖、糊精与样品同时做电泳，然后将中性物质的移动距离扣除后再测量泳动距离。电内渗因支持介质表面带电基团的多少而异，在琼脂糖凝胶中，能看到较明显的电内渗现象，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电内渗现象可以忽略不计。因此，在做大分子物质等电聚焦时，必须使用电内渗很小的琼脂糖，电内渗大的琼脂糖会使pH值梯度向阴极漂移，得不到正确的等电点。sjgma试剂手册在琼脂糖规格中均标出电内渗(EEO)值，应根据不同实验要求选用不同规格的琼脂糖。 6．分子筛效应在不同浓度和交联度的凝胶中，其孔径大小不同，通过分子筛效应可将不同大小的颗粒进行分离，其分离机制是小分子通过凝胶微孔，而大分子颗粒难通过微孔而使迁移阻滞，从而将被分离的颗粒，按分子大小的顺序排列进行分离。查看更多

0条评论

实验样本的收集保存和运输要求? 1：病理标本收集及保存： 1）冰冻切片：取下适当的组织块放于液氮保存； 2）石蜡切片：取下适当的组织块放于4%多聚甲醛保存； 3）细胞爬片：细胞爬片4%多聚甲醛固定30min，换PBS浸没4℃保存。 2：分子生物学标本收集及保存： 1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存； 2）石蜡标本：常温保存； 3）全血标本：取适量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管； 4）体液标本：高速离心取沉淀； 5）细胞标本：细胞加TRizol裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。 3：蛋白质实验标本收集及保存： 1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存； 2）全血标本：取适量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管； 3）细胞标本：细胞加细胞裂解液充分裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。 4：ELISA、放免、生化实验标本收集及保存： 1）血清（血浆）样本：取全血加入促凝管（抗凝管），2500转离心20分钟左右，收集上清，液氮或者-80℃冰箱保存； 2）尿液样本：样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液参照此实行； 3）细胞样本：检测分泌性的成份时，样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；检测细胞内的成份时，用PBS稀释细胞悬液，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，2500转离心20分钟左右，收集上清同上； 4）组织样本：切割标本后，称取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备用。 5：代谢组学标本收集： 1）尿液样本：样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液等参照此实行； 2）组织样本切割标本后，称取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备用；查看更多

0条评论

如何正确选择ELSIA试剂盒? 一、根据实验物种及待检样品性质来选择ELISA 如果实验君的实验样品为人、小鼠或大鼠样品，那么要选择一个合适的试剂盒相对容易，但如果您的实验样品来源于其他物种如鸡、牛、猴等，则市面上能提供的试剂盒种类却很少。且不可轻信能提供近万种试剂盒，覆盖多物种的供应商。但如果又非要检测这些物种的指标时，最好要对待检物(如有种属差异性)进行同源性分析以及试剂盒的种属交叉反应数据。对于样品类型而言，一般的商业化试剂盒都经过血清、血浆和细胞培养上清液的验证。在选择试剂盒时，最好要详细阅读说明书，比如血浆样本抗凝剂的使用是否与试剂盒兼容。另外，在某些情形下样品中会存在干扰因素比如溶血血浆、高脂肪含量的样品、人抗鼠抗体(HAMA)、细胞培养上清中含胎牛血清等。因此需根据样品来选择试剂盒，必要时还要根据样本来适当优化。或在样品收集前，最好先阅读一些可靠供应商试剂盒的说明书或直接咨询。如果您的样品为组织或细胞裂解物，则需要更谨慎的选择试剂盒。市面上大多数的商业化试剂盒没有经过多种来源组织样本的验证。这需要实验君能理解不是所有试剂盒所用的抗体对，都能特异的从一堆裂解物蛋白中特异检出您的目的蛋白，还要考虑组织样品的基质效应(Matrix Effect)等。但如果实验君要了解组织样品的制备问题，我们另起一文来总结。二、细致比较试剂盒关键性技术参数 ELISA试剂盒的关键技术参数包括板内差异性、板间差异性、批间差异性、重复性、特异性及交叉反应性、回收率等。如果实验君经常开展ELISA实验，建议使用同一厂家的试剂盒，这样可尽量保证数据的重复性(当然前提是实验条件的一致性)。对于科研用的定量ELISA试剂盒，不同的生产厂家使用的抗体对、酶以及底物、生产工艺和研发实力不尽相同，自然不同厂家试剂盒测出的数据会有差异。三、根据样品中检测物水平来选择试剂盒如果实验君对于样品中待检物的水平没有任何可参考的数据，zui好选择宽动力学检测范围的试剂盒。如果样品中待检物的含量很低，建议选择高灵敏度的试剂盒。为了降低基质效应，有必要用稀释液至少做2倍稀释。如果样品中待检物含量远超过试剂盒的检测范围（标曲范围），也需做适当的倍数稀释。在最后计算结果时，需乘以相应的稀释倍数。四、供应商资质评估纵观国内外ELISA试剂盒供应商，估计至少100余家。有些供应商可提供数百种常用指标ELISA，然而有些供应商则声称可提供数千种甚至上万种指标的试剂盒，但质量参差不齐，更有滥竽充数祸害科研之辈。那如果选择供应商呢？ 1、从同行或实验室同僚了解供应商的口碑，售前售后的处理情况。 2、查询供应商的wang站详细了解相关指标，可查询这些指标是否已经开发出特异性抗体？如果查遍全球连抗体都还不可获取，又如何开发出ELISA试剂盒呢？第3、文献引用是王道，尤其是SCI期刊文章对供应商产品的引用。 4、了解供应商的研发历史和品牌史，很多供应商频频更换公司名或更换公司注册地，其中名堂实验君应该能悟出。不要迷信国外“品牌”，国外“品牌”不代表是国际知名品牌。很多打着国外旗号的公司，其实就是空壳的皮包公司，从全球OEM劣质产品。国外供应商也有售后不给力的时候。五、根据样本可获得性来选择试剂盒通常而言，商业化试剂盒的样品用量都在50ul或100ul, 但也有一些供应商的试剂盒对样品的用量要求可少至10ul。如果您的样品很珍贵或较难获取，则需要认真考虑试剂盒对样品用量的要求。如果样品量少，且要做多因子检测时更需谨慎。六、经费预算说了半天，还是要看课题经费的预算。没经费咋搞科研呢？国际公认的知名品牌一般质量可靠，文献引用多。但国际品牌由于进口和国际运输等成本较高，因此售价也较高。其实国产品牌也是不错的选择，因省去不少物流和报关费用，与国外进口试剂盒相比价格上有比较大的优惠，而且能提供比较灵活的包装规格, 如48tests小包装，非常适合中国国情。国内ELISA品牌靠谱的还是有4到5家，这里就不做硬广告了，实验君可以上丁香通、小木虫等行业资讯平台或论坛等了解。七、认清订购渠道不论是国际还是国内品牌，都需要在订购前先与生产厂商详细沟通产品细节（比如酶标板是否可拆卸），了解售前售后技术服务能力等。然后咨询其订购渠道，比如直接向厂家订购或通过中国区或省级授权代理商经销商订购。谨防jia冒产品，花了钱是小事，实验数据的可靠性、真实性是大事呀，耽误了时间延迟了毕业更是不无处诉苦！空留伤心泪。选择正规渠道，选择品质！早发高质量Paper!查看更多

0条评论

ELISA实验中为什么时常会出现复测现象? 在ELISA实验过程中时常会出现复测现象，即我们时常说的"花板"现象，这种现象影响检验结果的正确判读，对工作造成一定的不利影响，一旦出现“花板”，实验结果必须放弃，重新进行，不仅浪费物料和时间，而且还会出现样本量缺少、交叉污染、报告延迟等一系列问题。出现这现象的影响因素分析如下 1、标本因素正确处理标本，防止大规模溶血、血浆层异物、使用一次性加样枪头，防止交叉污染。血清和血浆均可以用于检测，但血清的分离应在抽血后等血液完全凝固后再离心。 2、试剂因素正确保存及使用有效试剂。使用过期试剂及底物接触金属容器、底物混合后放置时间较长均影响实验结果的准确性。选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好，批间差小的试剂。不同厂家的试剂不能混用，包括底物和洗涤液。检测前应将试剂放置室温平衡半小时，洗涤液应现用现配，同时观察浓缩洗涤液中有无结晶，若有结晶应放37℃水浴中融化后才可使用。 3、技术人员操作因素严格按照相关实验SOP操作实验。加样时应尽可能的垂直加样，并加在包被孔的底部（注：勿应用力过度破坏底部包被物质），不可加在孔的上部及外部。 4、温浴的因素使用水浴箱作为温浴设备时，应注意水的深浅对结果的影响，当水浴箱中水的的实测温度37℃时，则水面温度可能只有34℃，空气温度更低，甚至只有二十多度，所以当水浴箱中水位过低时则酶标微孔板没有浸入水中，则反应温度会达不到37℃，相应的就会影响酶促反应。为防止边缘效应，酶标板应尽量浸入水中，以保证受热的均匀。水浴时，酶标板应封好，以免水滴滴入包被孔中，或阳性标本的蒸发。严格掌握温浴时间，不可为了早点出结果擅自缩短温浴时间。 5、洗板机的因素废液瓶装满后应及时清空，以防止废液回流对管道的污染，而使洗涤不彻底，造成“花板”。洗板结束后应用蒸馏水彻底清洗管道，以防止废液在管道中的残留。同时应根据仪器维护保养程序，定期对洗板机进行维护保养。 6、酶标仪酶标仪应安置在避光条件下，比色前应提前15-30分钟开机预热，这样测定结果会更稳定。为防止显色的加深或减弱，显色时间完成后应立即滴加终止液（避免气泡产生），并在10分钟内完成比色。酶标板从水浴箱取出后应擦净孔底水滴，若有水滴或纸屑残留在孔底，会造成酶标仪读数错误，误判定为“花板”。查看更多

0条评论

化学试剂变质了怎么办? 一.化学试剂为啥会变质环境主要是指贮存的温度、光照和介质。介质一般是指空气和混有的杂质。贮存室里除空气中含有的氧、二氧化碳和水蒸气以外，还往往含有存放的各种挥发性试剂扩散到空气中的蒸气，常见的有氯化氢、硝酸、硫化氢、二氧化硫、溴、碘、乙烯、甲醛等蒸气；另外还有飘混在空气中的尘埃，其中有无机物也有有机物及各种微生物。化学试剂在一定的温度、光照、介质条件下会逐渐变化以致变质，该过程有物理变化，亦有化学变化。前者使化学试剂产生损耗，后者则能使试剂完全变质失效。引发和促使化学试剂发生变化的原因，大致可归纳以下几个方面： 1.挥发挥发是挥发性试剂造成试剂损耗、浓度改变、规格下降的最常见的原因。挥发性试剂的一般特点是：分子量较小、沸点较低。常见的无机试剂有：浓盐酸、浓硝酸、发烟硫酸等，有机试剂则有碳原子数较少的液态物质，如：甲醇、乙醇、石油醚、汽油等。 2.升华具有升华性质的一类试剂一般是升华热较少的分子晶体。实验室里一般有室温下升华的试剂(如碘萘等)和受热条件下升华的试剂(如硫与氯化汞)两种。这类试剂的升华主要造成损耗和污染空气。 3.潮解和稀释能发生潮解的化学试剂为数不多，它们大部分是易溶性化合物，一般阴离子半径远小于阳离子半径，也有阴阳离子半径相近而阳离子所带电荷较多。此类试剂吸收水分在表面形成饱和溶液后，若产生的水蒸气气压小于空气中的水蒸气分压，潮解将继续进行，直至全部形成溶液。如：氢氧化钠、碱石灰等，有机物中易潮的有醋酸钠、醋酸铵等。稀释是指试剂溶液吸收空气中的水分导致浓度下降变稀的现象。发生原因与潮解一样，是外界水蒸气分压大于试剂的水蒸气分压所致。易发生稀释现象的常见试剂有浓硫酸、正磷酸、乙二醇等。 4.风化风化的原因和潮解相反，是结晶水合物的水蒸气分压高于空气中水蒸气分压的缘故。空气越干燥，风化速度越快。实验室中常见的易风化剂有：Na2CO3?10H2O、Na2SO4?7H2O、CuSO4?5H2O、MgSO4?7H2O、ZnSO4?7H2O等。发生风化虽未波及试剂的化学性质，但使试剂外观改变，质量减少。 5.浓缩和析晶浓缩和析晶产生的原因是在环境干燥的条件下，试剂溶液的水蒸气压高于外界空气中水蒸气压，造成溶液水分的蒸发而浓缩、析晶，各种固体溶质的试剂一般均有此类现象，特别是一些浓度较大的溶液，浓缩和析晶虽对瓶中试剂性质影响不大，但也会改变其浓度、规格和外观。对某些溶点较低的有机物，在外界温度下降较大的情况下，也会发生析晶现象，比较明显的例子是冰醋酸。 6.水解容易水解的盐类试剂大都具有共价键，凡是强酸和弱碱和弱酸和弱碱所生成的盐，遇水都会发生不同程度的水解。实验室中一些金属元素的卤化物很容易水解，如：TiCl4、AlCl3、FeCl3、SnCl2等，它们是带电荷高、半径小的阳离子化合物或是非惰气型的阳离子化合物。此类试剂可因易吸水水解而变质，易水解的有机物是含有酰基的化合物，如：酯、酰卤等物质。 7.分解分解反应也是引发和促进试剂损耗和变质的原因。试剂的分解速度通常和环境温度密切相关。温度高分解速度加快，通常易分解的二元化合物其化学键键能较低。键能越低，越易分解，例如：碘化合物就比溴化物更易分解。有的分解反应还和试剂的含水量有关，如：硫酸氢铵，含水量越大，温度越高分解速度也越快。而含氧酸盐，如：硝酸盐、高锰酸盐则要在受热时才发生分解。 8.氧化和还原通常易被氧化的是标准电极电位低，具有还原性的试剂，它的名称中常常带有“低”或“亚”字。还有部分活泼金属和非金属单质，过氧化物及某些有机试剂，常见的有硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、亚硫酸、无水亚硫酸钠、钠、钾、钙、锌粉、还原铁粉、乙醛等。还原性越强的试剂越易因氧化而变质，使其氧化的原因是空气中的氧和具有氧化性的杂质所为。标准电极电位较高的试剂，在以固态形式存在时，通常在空气中比较稳定，如：高锰酸钾、重铬酸钾等。但以溶液存在时就易和空气中的一些还原性杂质，如H2S，SO2等作用而变质，如：KMnO4，Na2S2SO4，K3Fe(CN)6等溶液。 9.非氧化—还原反应有些试剂的变质并非一定要引起元素价态的变化，即发生非氧化——还原反应也能使其失效。实验室中最常见的实例，如：生石灰因吸收水分变成熟石灰，进一步吸收二氧化碳而失效；氢氧化钠和氢氧化钾固体也因吸收二氧化碳而带有杂质，若长期暴露在空气中则完全转化成碳酸盐；此外氧化镁、氧化钡、氢氧化钡也应防止它们和空气中二氧化碳反应。 10.聚合和缩合分子结构中含有不饱和双键或叁键的有机物质容易发生聚合，如：甲醛溶液常会聚合生成白色的三聚甲醛，氰化钾试剂也易聚合。有电荷高、半径小的中心离子形成的含氧酸盐溶液则能因缩合而析出多酸盐沉淀，如：钼酸铵溶液能缩合析出四钼酸铵沉淀，三聚甲醛经加热处理尚可重新释放出甲醛气体，但有些试剂，一旦发生聚合或缩合反应，往往是不可逆的，从而造成变质失效。 11.光化学反应光作为一种能量也能使某些试剂反应而变质。光能引发分解反应导致银盐分解就是实例。光也能引发氧化反应，如：苯甲醛在光照下，易被空气氧化成苯甲酸，苯胺则能从无色变成棕色。此外，碘化汞、邻苯三酚、氯仿，硫酸汞、亚铁氰化钾等也易发生光化学反应。 12.霉变所谓霉变则指在化学试剂中霉菌滋生繁殖的现象。在空气中尘埃里含有无数菌类微生物，在一定温度条件下就能繁衍。实验室中的碳水化合物，酯类、蛋白质类试剂，含有氮、硫、磷的有机试剂正是菌类繁衍的良好营养物质和温床。上述试剂只要密闭不严与空气有所接触皆可发生霉变。化学试剂因上述原因发生各种变化，通常借助颜色、形态、气味、数量增减均可察觉，而有的变化则需用实验方法方可判别，如：无水酒精是否已含有水分，只能用专门的试剂标准和检验方法加以测定才能确定。因此，科学贮存各类试剂乃是一种用心细致的工作，其中大有学问和文章可作。二.如何预防、缓解化学试剂变质？为了保证化学教学、科研和化工生产的正常开展，降低试剂损耗，缓解试剂的变质，通常可采取的方法与措施： 1.密封这是最普遍通用的方法。试剂瓶的材料和密封程度应根据试剂性质而定。如：强腐蚀的“三酸”和液溴，可用带磨口玻璃的试剂瓶，或是有塑料衬垫的螺旋盖的玻璃瓶，氢氟酸则应密封贮藏在银制或塑料制容器内，等等。密封适用于易挥发、升华、潮解、稀释、风化、水解和氧化还原、霉变的所有化学试剂对于极易分解产生气体的试剂，一般不完全密封，要适当留有余地，否则可能使容器破裂。除了一般密封外，可再加蜡封，或用自制硝罗酊封口，如：三氯化铝、五氧化二磷等。 2.隔离能和空气、水作用的试剂，如：很活泼的金属和非金属应隔离存放在对试剂相对而言稳定的液体或惰气之中，钾、钠、钙浸没在机油中，黄磷则浸没在水中贮放。这种隔离方法也称液封法，前者叫油封，后者叫水封。水封存也可使某些容易挥发的试剂减少损耗。如：在装有液态溴、二硫化碳的试剂中加一薄层水，就能大大减少挥发损失和空气污染。实验室中无机、有机试剂种类繁多，性质各异，应注意合理分类存放。有机物、无机物分开，普通药品和危险的分开，氧化剂和易燃物、还原剂分解、易挥发性酸和碱分开。做到这几个分开，一可避免药品间的不良影响，二则即使有意外事故发生，也能免除药品的相互作用，而产生更大的隐患。 3.避光通常采用遮光性能较好的深棕色试剂瓶。将试剂放在暗处或遮光的专用试剂柜中。也可用照相纸的黑色厚纸包裹试剂瓶，如：浓硝酸、碘化钾、碘化钠、氯化汞的贮存就是如此 4.低温普通挥发性试剂常放置在阴冷处，如：浓硝酸、浓盐酸、氨水等。某些特殊的生化试剂则要贮放在水箱或冰箱之中，如：酶试剂等。 5.通风尽管装化学试剂的容器一般都处于密封状态，但也难免有跑、冒、漏、泄发生，在夏季高温天气，更易形成爆炸性混合气体，因此，贮藏室必须通风良好，应安装专用排风扇，并经常开启，使空气流通。 6.适时这是根据某些试剂的特性，特别是一些极易变质失效的试剂应采取适当措施，应做到适时配制、适时使用和及时处理。如：极易氧化的氢硫酸溶液、氯水、溴水、碘水最好适时制备及时使用；做银镜反应的硝酸银溶液、氨水、乙醛溶液配好后，应及时使用才不致影响效果；硫酸亚铁溶液配好后应加些还原铁粉才能使其不被氧化；淀粉、蔗糖、蛋白质的溶液在使用后应及时清洗试剂瓶，以防霉变。上述诸种试剂在配制时除应注意适时外，配制数量也应根据需要而定，以免过剩造成浪费。查看更多

0条评论

来自话题：

微生物

，

如何区分抗真菌、细菌化合物库、抑制剂? 首先明确一下，抗生素不是消炎药。抗生素是一种抗感染的药物，而消炎药具有消炎止痛的作用。在讲消炎药和抗生素之前，让我们先明确两个概念，炎症和感染，并看一下二者之间的关系。抗生素的作用机制感染是由细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。感染可以引起炎症反应，如流感可以引起全身的发热，头痛，这就是因为流感病毒感染在体内引起的炎症反应。确切的说，炎症不是一种疾病，而是一种现象，通常表现为红，肿，热，痛等。除了感染可以引起炎症之外，过敏、强酸腐蚀、外伤等也可以引起炎症反应。所以感染和炎症之间既有联系，又有区别，所以在用药上也存在很大差异。消炎药可以减缓炎症因子引起的机体的红肿热痛等现象，具有消炎止痛的作用。对于非感染引起的炎症具有较好的治疗效果，但对于感染性炎症，单纯的消炎药无法达到治疗目的，还需要抗感染药物的配合。由于感染又分为细菌感染，真菌感染，病毒感染等，针对不同的感染类型需要服用不同类型的药物。抗生素只是抗感染药物的一种，主要对抗生素敏感的细菌引发的炎症具有较好的效果，但对于病毒，真菌，过敏或外伤等引起的炎症却无能为力。所以得了流感，服用头孢是没有作用的。最正确的方法就是遵循医嘱，对症下药。讲到这里，可能已经清楚了消炎药与抗生素的区别，但对抗感染是否又有些小混乱？在科研中，如何区分哪些是抗细菌，抗真菌，抗病毒的化合物呢？这个不用担心，MCE 抗细菌化合物库和抗真菌化合物库，这两个化合物库中包含通过各种机制抑制细菌或真菌生长的抑制剂，如抑制细胞壁的合成；破坏细胞膜通透性，干扰蛋白合成及抑制核酸转录复制等。结合抗病毒化合物库及抗感染化合物库，为您在抗感染领域的研究中提供更多便利。查看更多

0条评论

来自话题：

工艺技术

，

多肽合成是怎么样建立的? 多肽固相合成法是多肽合成有机化学的一个重大的提升。它的最大的优点是不必纯化中间物质，合成过程能够连续开展，从而为多肽合成的自动化奠定了基本。目前全自动多肽的合成，基本上全是固相合成。其主要过程以下：根据Fmoc化学合成，先将所需合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不可溶的高分子树脂相接，然后以这一氨基酸的氨基做为多肽合成的起始点，同其他的氨基酸早已活化的羧基功效产生肽键，持续重复这一过程，就可以获得多肽。依据多肽的氨基酸构成不一样，多肽后处理方法不一样，纯化方法也是有差别。 1.做免疫用的多肽多长为合适? 一般约10-15个氨基酸，自然长一些免疫效果非常的好一些，但是合成费用也会提升。MAP多肽则期待长短在15aa之上，实际效果不错。此外，10aa下列的多肽免疫实际效果非常差。 2.免疫用多肽的纯度必须很高吗? 一般而言，免疫用Peptide，70-85%就可以。 3.大家合成的多肽溶解性不太好，多肽就有问题对不对? 难以准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。假如多肽无法溶解就觉得多肽合成有问题这一观念并有误。 4.多肽情况是怎样?如何保存存储? 大家带来的多肽是粉状，一般为灰白，构成不一样，多肽粉末状的色调有差别，多肽一般长期性储存必须遮光储存，并应储存在-20度，短期内能够储存在4度。能够短期内得话是以室内温度运送。 5.怎样溶解多肽溶解多肽是比较复杂的事儿，一般难以一下子明确合适的有机溶剂。一般是先取一点实验，在都没有明确合适的有机溶剂前千万别合部溶解。以下方式有利于您挑选合适的有机溶剂： (1)判断多肽的正电荷特殊，设置酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1；碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其他氨基酸的正电荷为0。测算出将电荷数。 (2)假如净电荷数 0，多肽为碱性，自来水溶解：如果不溶解或溶解性并不大，加入醋酸(10%之上)；假如多肽还不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。 (3)假如净电荷数 (4)假如净电荷数=0，多肽为中性，一般必须用有机溶剂如乙腈，甲醇或异丙醇，DMSO等溶解。也有人建议必须尿素来溶解疏水性非常大的多肽。 6.非HPLC纯化的多肽中有什么杂质? 粗品和除盐等级的多肽中多肽和非多肽类杂质：如非总长多肽和多肽后处理的一些原材料如DTT、TFA等。 7.HPLC纯化的多肽有什么杂质? 历经HPLC纯化的多肽，仍会出现一些一些杂质存有，在其中的杂质主要是短肽和少量TFA。 8.多长的多肽为合适? 多肽合成必须考虑到多肽的长短，正电荷，亲疏有别水溶性等要素。长短越长，合成粗品的纯度和产出率都随之减少，纯化的困难和没法合成的概率便会大些。自然多肽功能分区的编码序列是难以更改的，可是为了更好地多肽的顺利合成，有时候必须在作用取的上中下游提升一些辅助氨基酸，以改进多肽的溶解性和亲疏有别水溶性。假如多肽过短，合成也很有可能有问题，关键情况是合成的多肽后面处理方式中有一定的难度系数，5肽下列的多肽，一般要有亲水性的氨基酸，不然后处理难度系数增加。15个氨基酸残基下列的多肽一般都能够取得认可的产出率和得率。 9.怎样从多肽编码序列中判断多肽的溶解性? (1)多肽中假如带有高比率的疏水性较强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽难以溶解与水溶性水溶液中或压根不太可能溶解。这种氨基酸不论是纯化或合成，都是有很有可能有问题。 (2)一般状况下疏水性氨基酸的占比带有Cys,Met，或Trp的多肽无法合成，与此同时难以获得高纯的商品。关键是因为这种官能团不稳定，易空气氧化。这种多肽的应用和存储都必须需注意，防止不断打开外盖。 10.为何有一些多肽的合成产出率或纯度会非常低? 多肽合成与引子合成有非常大的差别，不可以合成的引子非常少，可是不可以合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这种氨基酸邻或重复时，多肽链在合成过程中无法完全舒展溶解，合成效率降低。下列多种情况，合成效率和物质的纯度都非常低，如：重复Pro,Ser-Ser，重复Asp，4个连续Gly等。 11.多肽是怎样纯化的? 多肽纯化一般应用正相反柱(如C8，C18等)，214nm。缓存管理体系一般为含TFA的有机溶剂，pH2.0。BufferA为含0.1%TFAinddH2O，BufferB为1%TFA/ACN/pH2.0。纯化前用BufferA溶解；假如溶解不太好，用BufferB溶解后，然后用BufferA稀释；对疏水性强的多肽，有时候还必须加入少量的FormicAcid或醋酸。HPLC剖析多肽粗物质，假如多肽不长(15aa下列)，一般会出现主峰，主峰一般为总长物质；针对20aa之上的长肽，要是没有主峰，HPLC需配搭Mass来判断相对分子质量，从而明确哪个峰是所需合成的多肽。查看更多

0条评论

哪些原因会导致酶制剂的失活? 一、PH值的影响每种酶仅在特定的pH范围内才表现出较高的活力，该pH值即是酶作用的合适pH值，酶在合适pH值表现就会很稳定。若酶反应pH值过高或过低，酶都会受到不可逆的破坏，稳定性、活力下降，甚至失活。而且不同酶的合适pH范围不同，偏酸性、中性、偏碱性的都有。二、温度的影响在一定条件下，每种酶都有一个合适作用的温度，在此温度下酶活力zui高，作用效果zui好，酶也较稳定，酶催化反应的速度增加和酶活力的热变性损失达到平衡，这个温度便是酶作用的合适温度。每种酶都有一个活性稳定的温度，在此温度下在一定的时间、pH和酶浓度下，酶较稳定，不发生或极少发生活力下降，这一温度为酶的稳定温度。超过稳定温度进行作用，酶会急剧失活。温度对酶作用的影响还与其受热的时间有关，反应时间延长，酶的zui适温度会降低。三、酶浓度和底物浓度的影响底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素，在一定的温度、pH及酶浓度的条件下。底物浓度很低时，酶的催化反应速度随底物浓度的增加而迅速加快，两者成正比。随着底物浓度的增加，反应速度减缓，不再按正比例升高。有时底物浓度很高，还会因底物抑制作用造成酶反应速度下降。当底物浓度大大超过酶浓度，酶催化反应速度一般与酶浓度成正比。此外，如果酶浓度太低，酶有时会失效，使反应无法进行。四、抑制剂的影响许多物质可以减弱、抑制，甚至破坏酶的作用，这些物质称为酶的抑制剂。如重金属离子（ Fe3+ 、 Cu2+ 、 Hg+ 、 Pb+ 等）、一氧化碳、硫化氢、有机阳离子、乙二胺和四乙酸等。实际生产中，要了解和避免抑制剂对酶催化作用的影响。五、激活剂的影响许多物质具有保护和增加酶活性的作用，或者促使无活性的酶蛋白转变成有活性的酶，这些物质统称为酶激活剂。激活剂可分为三类：第一类是无机离子，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+ 、Zn2+等阳离子，以及Cl-、NO3-、PO43-、SO42-等阴离子。第二类是分子较小的有机物，主要是维生素B族及其衍生物。第三类是具有蛋白质性质的高分子物质。激活剂对酶催化反应速度的影响与底物浓度相似，但在实际生产中应用很少。六、保存环境的影响酶制剂在低温环境下处于休眠状态，要使酶长期保存而不失去活性，在10℃保存酶活损失5-10%/6个月，常温保存酶活损失10-15%/6个月。所以关键在于环境干燥和低温。热和光照都易使酶失去活性，因此，酶制剂应密闭储存在低温避光处。另外，酶制剂水分含量越高，越易失活，故一般粉状酶制剂易于保存和运输。此外，有些金属离子也能引起酶失去活性或抑制酶的活力，应避免选择金属离子的容器来保存酶制剂。查看更多

0条评论

毒性噬菌体和温和噬菌体有什么区别? 1.毒性噬菌体指在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。毒性噬菌体的增殖方式是复制，其增殖过程经历吸附穿入、生物合成和成熟释放3个阶段。进入菌细胞内的噬菌体核酸首先经早期转录产生早期蛋白质，并复制子代核酸，再进行晚期转录产生噬菌体的结构蛋白。子代噬菌体达到一定数量时，由于噬菌体合成酶类的溶解，菌细胞突然裂解，释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌。 2.温和噬菌体感染宿主菌后并不增殖。其基因整合于细菌染色体上，即前噬菌体，随细菌染色体的复制而复制，并随细菌分裂而分配至子代细菌的染色体中。温和噬菌体有溶原性周期和溶菌性周期，可偶尔自发地或在某些理化或生物因素地影响下，整合的前噬菌体脱离宿主菌染色体，进入溶菌性周期导致细菌裂解，并产生新的成熟噬菌体。查看更多

0条评论

你还搞不清楚病毒载体的用法? 基因表达载体是广大科研人员普遍需要的研究工具，而病毒载体凭借其优良效能则越来越成为最shou欢迎、也最为普遍的基因表达载体。然而病毒载体也分为好几类，不同实验类型、不同研究目的、不同“受体”性质需要我们准确评估与选择。因此，详细了解不同病毒载体的相关知识是我们科研人员必须掌握的。本文详细介绍了常见病毒载体的原理、特点和适用范围。一、慢病毒载体慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒的一种，有由于其感染潜伏期较长，临床症状发展缓慢，被称为慢病毒。而慢病毒载体则是在慢病毒的基础上改变重组其构成原件，进而在去除其生物危害性的同时，利用其高感染等性能表达目的基因。人类免疫缺陷病毒（HIV）是常见的慢病毒载体改造原型。如下以HIV中最为常见的HIV-1型： HIV-1为双链RNA病毒，主要组分包含三种重要病毒核心基因：gag（编码结构蛋白或称为核心蛋白），pop（编码复制相关酶类），env（编码包膜糖蛋白）；调节基因：tat（转录控制）和rev（表达调节）；四个辅助基因：vif、vpr、vpu、nef（作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染）；两端为长末端重复序列LTR (内含复制所需的顺式作用元件)。第一代慢病毒载体为双质粒系统，基本保留了HIV的所有组件，产毒滴度低，复制缺陷，且存在产生复制能力的活性HIV病毒的可能；第二代慢病毒载体为三质粒系统，分为包装质粒、包膜质粒和载体质粒，其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓宽了病毒的感染宿主细胞范围，虽然三质粒降低了病毒重组的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附属基因，产生活性HIV依然存在可能；第三代慢病毒载体则去除了HIV病毒所有辅助序列，只保留核心的3个基因（gag、pol、rev），病毒RNA不能转录，故意外重组的可能性很低；第四代慢病毒载体为四质粒系统，即将病毒核心基因分散在多个质粒中(pGag/Pol、pRev、pVSV-G和载体质粒)，同时去除tat，故病毒重组、产生活性病毒的可能进一步降低，同时四质粒系统中的载体质粒中可以包含可诱导基因，使得该基因表达系统可以条件性调控。慢病毒载体感染能力强、且宿主广泛（分裂和非分裂细胞）；能够整合进宿主DNA且筛选后稳定遗传；表达潜伏期短，一般细胞24h-48h、体内96小时可表达；慢病毒载体可以插入组织特异性启动子或增强子；慢病毒携带基因的长度大致无5kb以内。由于慢病毒依然是HIV来源，自然宿主是人，依然存在潜在的生物毒性，故操作时避免直接接触人体。慢病毒载体适合常见类型的体外研究（细胞），包括过表达、敲除、敲低都基因干预操作，但慢病毒载体不适合于体内研究，因为其滴度不能够满足体内用量且免疫原性较强。二、腺病毒载体腺病毒（Adenovirus）是一种线性无包膜的双链DNA病毒，腺病毒的衣壳结构可以分为五邻体和六邻体两部分，腺病毒的基因组主要包括病毒DNA复制前期的Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4（编码病毒调节蛋白）和DNA复制后期的Ll～L5（编码病毒结构蛋白），以及两端的反向重复序列，ITRs（包装所必需的顺式作用元件）。在天然腺病毒（主要是人5型腺病毒）的基础上改造而得的腺病毒载体，其基因携带量增加，感染效率增加，且生物毒性降低。第一代腺病毒载体是删除Ela、Elb基因的复制缺陷病毒，其复制必须在表达E1蛋白的细胞中，病毒滴度高且稳定，不整合宿主基因组，但包装量少（约为4.5kb），免疫原性强；第二代腺病毒载体进一步删减病毒原有基因，在减少免疫原性和细胞毒性的同时，进一步提高载体容量，可以达到14kb，但是病毒滴度较低；第三代腺病毒载体则只保留了ITRs和包装信号序列，因此其携带外源基因容量更大，约36 kb，但由于病毒包装基因必须基因被删除，第三代腺病毒载体工作组装需要辅助病毒（表达腺病毒装配必须基因），第三代腺病毒载体容量大，免疫原性低，但是量产困难，存在辅助病毒污染风险。腺病毒感染力强、宿主范围广（分裂和非分裂细胞），表达迅速（24h-48h）且表达量高，包装容量大，但腺病毒不能整合入宿主基因组内，规避了整合入宿主基因组的生物风险，安全的同时也形成了细胞分裂过程中不能均等分配给子细胞。腺病毒载体适合一般体外实验，使用细胞类型较多，免疫原性较强，不适合体内实验。三、腺相关病毒腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是无包膜单链线状DNA 缺陷型病毒，外包二十面体衣壳蛋白，基因组包括两端的反向重复序列ITR（包含复制和包装所需的唯1顺式作用元件），中间的两个核心基因：Rep 基因（编码参与病毒复制、包装和基因整合的蛋白），Cap（编码结构蛋白VP1、VP2、VP3）。AAV为复制缺陷病毒，不能独立存在，其复制增殖需要辅助病毒作用。衣壳蛋白不同的AAV病毒，对组织器官的亲和力不同，形成各种AAV血清型：如AAV1较易感染骨骼肌，AAV6较易感染肺部，AAV8则亲嗜肝脏，AAV9则为神经和外周组织（见后表）。腺相关病毒载体（重组腺相关病毒载体, rAAV）的发展同样在天然AAV的基础上不断优化改进。最早采用重组载体质粒、目的基因质粒、辅助质粒、腺病毒共转染细胞，步骤多、产率低、风险高；随后采用目的基因载体、AAV基因载体(rep／cap)、辅助质粒（包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似辅助功能的基因元件）共转染细胞，但包装效率低，生物风险高；Ad/AAV嵌合载体、辅助质粒感染恒定表达Rep/Cap细胞系的方法以及AAV生产细胞系法，这些方法均操作繁琐；目前最chang用的载体方法为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统：将rAAV包装组分AAV2的Rep基因序列、Cap基因序列、以及ITR-目的基因表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，分别转染昆虫细胞Sf9各自扩增，然后通过共感染Sf9细胞来生产rAAV，该方法可以量产、成本低、操作简单且不会对人体产生损伤。 AAV载体免疫原性极低，非常适合动物实验，感染效率高，宿主范围广（分裂和不分裂细胞），不整合到基因组，稳定表达持续时间长（半年以上），但是表达水平低且慢（细胞需要1周，动物需要2周），携带目的基因片段约为2kb。查看更多

0条评论

水饱和酚和tris饱和酚的区别? 1、水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的PH小于7，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，这样DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。 2、Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。 3、Tris饱和酚：1、冰箱取出重蒸酚，室温放置－－－68度水浴溶化，切勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂 2、加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，（原液14. 4MOL/ML），混匀，溶液呈现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行） 3、加入等溶剂的1MOL/ML的Tris(PH8.0),反复混匀后，静至分层；放出下层黄色酚液，弃上层 4、加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相 5、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)平衡数次，至PH为8.0 6、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)于棕色瓶中4度保存 7、如黄色消失或呈粉红色，则不能使用查看更多

0条评论

微生物培养基中的蛋白胨有何作用? 蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好物理性状。可配制各种微生物培养基。一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白(酪蛋白、肉类)和植物蛋白(豆类)两种。蛋白胨当中不仅含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，而且含有更多的细菌生长需要的维生素和其它生长因子。是生物制药发酵及各种培养基制备的基础原材料。在培养基当中它起的主要作用是提供氮源。蛋白胨的用途：实验室用作培养基，培养细菌。食品中用作提高蛋白含量。用于饲料中显着降低了饲料厂的生产成本，是饲料行业中蛋白源不足的良好佳品。胰酪蛋白胨是一种优质蛋白胨，亦称胰酶蛋白胨或称胰蛋白胨。该蛋白胨系采用酪蛋白经胰酶消化后，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好物理性状。可配制各种微生物培养基。酪蛋白胨是用酪蛋白经胰酶水解精制而成，色泽呈淡黄色或白色。月示胨采用精蛋白为基质，经特殊水解提取制备的干燥粉末，营养极为丰富，可做多种培养基的基础。大豆蛋白胨是是用大豆为基质，采用新工艺提取而成的淡黄色粉末，含有多种营养成份，适合做微生物培养用原料。专门用于培养链球菌、肺炎球菌、布氏杆菌等，营养丰富，也可用做工业化生产的发酵原料。牛肉蛋白胨用新鲜精牛肉，采用最新工艺精致而成在培养基当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足。多价胨采用先进生物提取工艺精致而成，为淡黄色干燥粉末，营养极为丰富，可做多种培养基的基础。适合奈瑟氏菌、沙门氏菌属等生长。骨蛋白胨系蛋白质分解产物，如将牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明胶、大豆蛋白、丝蛋白、血纤维蛋白等为原料，经不完全的水解工艺所得的产物。市售产品以淡黄至棕黄色粉剂为主。其分子量约2000左右。不同来源的蛋白质和不同的水解条件，其水解物中组成可千差万别。所以胨往往是一个复杂的多肽混合物。可溶于水，过热不凝固，在饱和硫酸铵中不发生沉淀但可为蛋白质沉淀剂所沉淀。可用作微生物和动物细胞培养基、特种功能性食品和化妆品的配料，也有用作啤酒等产品的稳定剂。查看更多

0条评论

来自话题：

微生物

，

质粒纯度不高怎么办? 1.混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。 2. 混有RNA：RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。 3. 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。 4. P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。 5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。 6. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。查看更多

0条评论

汤培养基和LB培养基有什么区别? LB是用来培养菌种的，能让菌种在里边成倍扩增；MH是用于抗生素敏感试验，也就是培养基上已经有某种菌种，我们要检测某种抗生素对该菌种的杀灭性，就往MH培养基上加抗生素。这样MH是可以分为数百种的，因为常见微生物就有太多种。查看更多

0条评论

来自话题：

生物医药

，

重组蛋白究竟是什么? 重组蛋白的产生是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。体外重组蛋白的生产主要包括四大系统:原核蛋白表达，哺乳动物细胞蛋白表达，酵母蛋白表达及昆虫细胞蛋白表达。重组蛋白获得途径：重组蛋白需要使用表达系统来对其进行制备，其获得途径可以分为体外方法和体内方法。两种方法的前提都是应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。体外重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达（最常用的大肠杆菌蛋白表达），哺乳动物细胞蛋白表达（常用的细胞CHO，HEK293），真核表达系统（酵母）及昆虫细胞蛋白表达。合适表达系统的选择取决于重组蛋白的特性、重组蛋白的预期应用以及该系统能否生产足够量的蛋白质，根据自身的下游运用选择合适的蛋白表达系统，提高表达成功率。重组蛋白表达系统：（1）目前应用最广泛的表达系统有三大类，大肠杆菌(Esherichia coli)表达系统、酵母表达系统、CHO细胞表达系统。其中，大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌，已应用于许多具有重要药用价值蛋白的生产。大肠杆菌表达系统具有许多优点，如生长快、培养成本低廉、遗传背景清楚和易实现高密度培养等。大肠杆菌DH5α是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。大肠杆菌DH5α是基因工程常用的宿主菌之一，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。（2）不同的表达系统和培养方法显着影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞膜内、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的的表达系统。重组蛋白种类：目前比较热门的重组蛋白主要为细胞因子类，而细胞因子主要包括如下：按功能分，可分为以下几种： 1、白细胞介素（Interleukin，IL）由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生且又在白细胞间发挥作用，所以得名，现仍沿用此名。 2、干扰素（interferon，IFN）具有干扰病毒复制的能力，故得名。其具有十分广泛的生物活性，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用，也是主要的促炎细胞因子之一。干扰素分为：I型（7种，如IFN-α和IFN-β）和II型（仅有IFN-Y）。 3、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）由于在体内外均可直接杀伤肿瘤细胞而得名。其家族成员约有30个。主要成员：（1）TNF-α，一种单核因子主要由单核细胞和巨噬细胞产生；（2）TNF-β，一种淋巴因子，主要由淋巴细胞、NK细胞等产生，其生物学活性与TNF-α相类似。 4、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）一组在体内外均可选择性刺激造血祖细胞增殖、分化并形成某一谱系细胞集落的细胞因子，包括巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、巨噬细胞/粒细胞CSF、干细胞因子等。 5、生长因子（growth factor，GF）一类可介导不同类型细胞生长和分化的细胞因子，根据其功能和所作用细胞的不同，分别命名为转化生长因子（TGF）、神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等。 6、趋化性细胞因子（chemokine）一类对不同靶细胞具有趋化效应的细胞因子家族，可由白细胞和某些组织细胞分泌，是一个包括60多个成员的蛋白质家族。大部分成员含4个保守的半胱氨酸（cysteine，C）根据其N端半胱氨酸的排列方式，可分为CXC、CC、C、CX3C四个亚族。查看更多

0条评论

来自话题：

微生物

，

如何留取细菌培养用的标本? 1.留取尿细菌培养标本应采用无菌容器收集尿标本。医务人员帮助清洗外阴部，特别是女性患者。具体清洗方法是：首先用1：1000的新洁尔灭浸泡过的棉球反复擦洗外阴部，再进行尿道口消毒，之后再打开无菌容器，让患者自然排尿，只收集中段尿液。留尿后立即盖好容器并尽快送到微生物实验室。如需要做结核菌培养，应尽量留取清晨第一次尿的全部尿液送检。 2.留取大便培养标本使用医院提供的无菌细菌培养用便盒，不能使用便常规检查用便盒。在留取标本前不能将盒盖打开。在采集标本时应仔细观察，尽量选择有粘液和脓血的部分，如表面无任何异常则尽量自粪便表面不同的部位、粪便深部挑取标本，尽量不要混入尿液以及便池、便盆内其他杂物。取好标本后，打开标本盒盖，将标本迅速放入、盖好，尽快送往微生物实验室。 3.痰液标本需要使用无菌标本容器。尽量采集清晨第一口痰，留标本前先用盐水漱口数次，将口腔中其他残留物，然后用力将气管深部积存的痰液咳出，（注意不要将唾液当做痰液送检）放在无菌容器中尽快送检。 4.血液、骨髓、穿刺液、脑脊液等特殊标本由医务人员抽取，放在特殊的培养容器中送检。需要做厌氧培养的标本应请有关专家对标本尽快采取隔离氧气措施并密封，不能自己采集这类标本。 5.咽拭子，是由医生在病人的咽部蘸取的特殊标本，放在一个有少量生理盐水的特殊试管中。当患者自己送标本去实验室时，千万不要打开试管塞，不要将标本中液体倾倒。所有自己送检的各类标本，一旦将标本放入后，就不要再次打开，在送往实验室过程中注意密封，避免空气中的细菌再次污染。采集有一定传染性的标本应由有关医务人员执行，并采取隔离手段，注意防止被感染和标本的播散，注意隔离和消毒措施，以免造成环境污染。尽快将标本送到医院检验科微生物实验室或细菌培养室。查看更多

0条评论

PBS和D-PBS缓冲溶液怎么配制? 磷酸盐缓冲液(简称PBS)的是生物化学中常用的一种阻碍溶液pH变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137 mM 氯化钠，2.7 mM 氯化钾，10 mM 磷酸二氢钠，2 mM 磷酸二氢钾。本文总结了PBS和D-PBS溶液的配制方法。 1. 常规PBS磷酸盐缓冲液组成成份：磷酸二氢钾 34 g 1 mol/L氢氧化钠溶液 175 ml 蒸馏水 825 ml PH 7.2 配制：先将磷酸盐溶解于500 mL蒸馏水中，用1 mol/L氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释至1000 mL。稀释液：取储存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL。分装每瓶100 mL或每管10 mL，121 ℃高压灭菌15 min。用途：主要用于一些化学实验中不影响实验反应的情况下调节pH值，以便让实验的化学反应在最佳条件下进行。部分用于食品或是饲料行业加工，如食品或者饲料真菌毒素检验中Elisa方法的洗板应用或者食品微生物检验中的稀释缓冲液。 2. PBS Buffer的配制具体步骤组份浓度： 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 配制量：1 L 配制方法：（1）称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.27 g （2）向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。（3）滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。（4）高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 3. D-PBS是杜氏磷酸缓冲液全称为：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 组分分子量浓度 (gm/L) 摩尔浓度 (mM) 氯化钾 (KCl) 75 0.20 2.67 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 136 0.20 1.47 氯化钠 (NaCl) 58 8.00 138.00 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 142 1.15 8.10 pH值为7.4。（1）杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，D-PBS)也是一种磷酸盐缓冲液，与常规PBS的不同之处在于磷酸盐的含量稍低些，并含有钙镁离子。D-PBS主要用于胚胎学方面的研究，多用于胚胎的冲洗液、冻存液和培养液。（2）D-PBS配方：氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.15 g，磷酸二氢钾0.2 g，氯化钙0.1 g，含6个结晶水的氯化镁0.1 g溶于1 L ddH2O中。（3）以上配方为含有钙镁离子的D-PBS，如不加氯化钙和氯化镁，即为无钙镁的D-PBS。（4）在以上配方的基础上，还可以加入葡萄糖、丙酮酸钠等，以更利于培养物的生长。 D-PBS是杜氏磷酸缓冲液，也是一种磷酸盐缓冲液，与常规磷酸缓冲液最大的不同点在于磷酸盐的含量稍低些，根据是否含钙镁分为两种即D-PBS w/钙 & 镁和D-PBS w/o 钙查看更多

0条评论

几种细胞凋亡检测方法比较? 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。第一种细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体第二种磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。方法 1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加入 100ul Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再加入 PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1h），同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性对照。 2、贴壁培养的细胞染色：先用 0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。注意事项 1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。 2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。第三种线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37癈平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。注意事项 1．始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。 2．与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。第四种 DNA--pian段化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。 1. 大分子染色体DNA--pian段的测定细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。 2． DNA Ladder 测定方法：收获细胞（1′107），沉淀细胞裂解液13000rpm′5min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56℃，2h蛋白酶K（2.5mg/ml）37℃，2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4℃过夜?14000rpm′15min，最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer，1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。 3．凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析方法：收集细胞，70%冷乙醇（in PBS）4℃固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10min，RNase A（0.5mg/ml）37℃消化30min，PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。 4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH) 优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。第五种 TUNEL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。查看更多

0条评论

为什么有时候菌种的保存效果不佳? 1、可能是由于保存后未将保存液吸尽，反复冻融形成冰晶损伤菌株细胞，影响了菌株活性。 2、确定所保存的菌种是否为对数生长期的菌种，我们建议普通菌种保存为18小时内的新鲜菌种，而霉菌需要待孢子出现后保存其孢子。查看更多

0条评论

凝胶迁移实验常见问题? 常见问题 1、为什么看不到迁移带？ 1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3）探针与蛋白无特异性的相互作用。 4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。 5）曝光或者成像时间过短。在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因： 6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。 7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少 8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。 9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。查看更多

0条评论

上一页16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26下一页

简介

职业：上海古朵生物科技有限公司 - 销售经理

学校： -

地区：上海市

个人简介：上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求”的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量”的方针。查看更多

企业简介

企业名称：上海古朵生物科技有限公司

企业性质：贸易商,代理商,

主营业务：质粒载体定制，ELISA检测试剂盒，细胞培养，抗体抗原，蛋白纯化，染色液溶液，标准品对照品,微生物培...

进入商铺

喜爱的版块返回首页

已连续签到天，累积获取个能量值

第1天
第2天
第3天
第4天
第5天
第6天
第7天